一种用于电化学定量PSA作为前列腺特异性诊断标记的敏感适配体生物传感器外文翻译资料

 2022-08-03 20:16:11

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2021年 2 月 27 日

一种用于电化学定量PSA作为前列腺特异性诊断标记的敏感适配体生物传感器

  1. 摘要

最近有一项项目研究目的是设计出一种简单的，高灵敏度的，经济且不会标记的电化学传感器来检测前列腺特异性抗原（PSA）,作为前列腺癌症的标准生物榜样。这个传感器是用金属纳米（Au，NPs）和硫化适配体修饰的丝网印刷电极（SPCE）。方法是：采用循化伏安法（CV）和电化学阻抗谱（EIS）相结合来实现对电化学传感器的电化学表征特点。对于PSA的测定也可以通过在[Fe (CN) 6]3-/4- 这种溶液中用微分脉冲伏安法来测定。这个的结果是：这个传感器在1 pg/mL ~ 200 ng/mL这个集中范围内表现出来杰出的线形反馈。最好的PSA浓度用于分离和最优的抗体-适配体结合的时间决定与在观察和在最适时间或浓度下选择最高的电化学反应。结论：根据这些特别规定的测试结果，这种设计出来的传感器没有表现出与其他真实分析样品相互作用。通过制作传感器和与参考的方法来检测PSA的水平，在健康的个体和患者中测试PSA水平来评估传感器的临床功能。同样的方法来对比灵敏度。拥有高灵敏度和高性价比这样的丰富特性的PSA传感器可以简便的生产和被用作人类前列腺问题的检测。

关键词：诊断（diagnosis） 癌症（cancer） 纳米金属（gold nanoparticles） 电化学传感器（electrochemical aptasensor）前列腺（prostate）抗原（antigen）

  1. 介绍内容

前列腺癌症是男性第二大癌症和世界第五大死亡原因。尽管他是第五大的生还率在所有的癌症中[1]。但是在晚期致命率高且不好治愈。根据这些案例，前列腺癌症应该在没有征兆或者早起就被治愈[2,3]，因为越早的诊断出来对于治愈十分关键。最近PSA这种34 kDa的单糖蛋白作为诊断前列腺癌症的金牌标准物[4]。这个是健康异常的前列腺细胞产出的。但是高于4ng/ml的血清可能与前列腺肿瘤有关[5]。

根据资料记载，大量的数据分析表明包括荧光技术测定PSA，例如[6～9]免疫层析实验，表面等离子共振[10]，表面增强拉曼散射[11]，化学发光[12]，电化学发光[13]，场效应晶体管实验[14]和电化学技术[15]等。最常用于临床的方法依旧是扩增荧光临近同源检测疫苗法（AlphaLISA）和酶联免疫吸附法（ELISA）[16,17]。尽管这两种方法有人人皆知的优点，但他们也有很多缺点，昂贵的化学品，必须用到化学发光，荧光，酶促等物质来作为抗原标记这些缺点也使得对于临川测试缺乏一点合理性[18,19]。

因此像核酸适配体（aptamer）这种高灵敏性和特别的物质来替代的策略才会那么重要。由于他们独有的特性，在极端的pH条件和温度下的友好的预处理已经成为优秀的抗体分析[20,21]。核酸适配体（Aptamer）是通过一种叫SELEX的技术选择的单链的DNAs或者RNAs。他们容易得到且可以直接制造[22,23]。除此之外感应器出了具有较高的特异性和与相对的物质结合，还可以利用有功能的物质结合使其适用与大量的应用[20,24]。总的来说这种具有高选择性和高性价比的生物传感器可以提供可高的结果来证明分析[25]。通过对比PSA的常规检测（ELISA）和生物传感技术的各个特点。一个生物传感器由生物传感元件和传感器组成[26,27]，被分为电化学，物理和光学[28]。电化学（EC）生物传感器因为其低花费，小型化，符合期待的灵敏度和程序检测花费时间少所以现在研究的选择和应用[25]。至于电子传感器选用的是丝网印刷的电极(SPCEs)因为他的重复性结果和每个测量所需的小体积样品和大规模生产{29,30}的可行性。在大量优点的适配体与抗体相比，之前提到的，PSA的特定适配体以及可以排列出来，特异性硫醇功能适配体被应用受体[19,20,31]。通过用金属纳米来对表面进行改性提供来实现更快，更有选择性的分析相应。我们报道关于新颖的无相互作用的电化学传感器是根据准确，重现性和高灵敏[32,33]测定临床血清样品中最低水平的PSA。

  1. 方法介绍
    1. 材料

基于先前的研究[34]，硫化PSA的适配体的序列是这样的(5-Thiol – (CH2)6-TTT TTA ATT AAA GCT CGC CAT CAA ATA GCT TT- 3) 是由德国NWG-BIOTECH分析合成出来的。前列腺特异性抗原PSA是从AdipoGen这家生命科学公司获得的。用18 MOmega;.cm的超纯水配置溶液。适体原液（20 u）置于PBS和-20度保存。从Firoozgar医院收集个人样品。这个方案得到了委员会的批准。（IR.TUMS.VCR.REC.1398.610）以及按早TUMS的伦理原则进行人体项目研究

表3.1德国NWG-BIOtech使用化学试剂

序号

分析试剂

化学式

1

二氧化硫

H2SO4

2

三羟甲基氨基甲烷

2-carboxyethyl

3

液磷化氢盐酸

TCEP

4

磷酸盐

PBS

5

6-巯基己-1-醇

MCH

6

三水合氯化金

HAuCl4.3H2O

7

铁氰化钾

K3[Fe(CN)6]

8

单磷酸

NaH2PO4

9

磷酸二钠

Na2HPO4

10

磷酸

H3PO4

11

氢氧化钠

NaOH

12

牛血清蛋白

BSA
    1. 装置

为了完成电化学性分析，一个名为AUTOLAB PGSTAT 101的电子工作室采用兼容性NOVA2.1软件。改性的SPCE在0.1 M PBS (pH 7.4) containing [Fe(CN)6]3-/4- / KCl (5 mM /0.1 M) 溶液中进行特征用来作为氧化还原探针使用的三种不同的EC技术循环伏安法（CV），电化学阻抗谱（EIS）和微分脉冲伏安法（DPV）电化学阻抗谱（EIS）是通过交流电（AC）在电压调节 10MV和100mHz和100kHz的频率范围内波动。交流电（CV）技术是用来对感应器传感程序制备进行评价。在-0.4～ 0.7 V之间用0.1 V/s的扫描速率对潜在的东西进行计算。微分脉冲伏安法（DPV）方法是在实验条件在 0.7～0.4 V之间，振幅在0.05 V之间使用。在电沉积过程中，FESEM公司对Au和NPs进行了评定。SPCEs测量为3.4*1.0*0.05来制定碳工作电极和碳计数器和银基参考电极。

    1. Au NP修改的SPCEs组件

在10 mM的HAuCl4.3H2O和0.5 MH2SO4. 通过Au NP电沉积法对工作电极界面来表面修改。SPCE是在-0.4 V～ 0.7 V和在0.1 M PBS（pH 7.4）的[Fe(CN)6]3-/4- / KCl (5 mM /0.1 M) 下作为电化学氧化还原探针，描述速率为0.1V/S下进行表征修订。在电极激活后，Au NPs在-0.2 V和HAuCl4/ H2SO4 (10 mM/ 0.5 M) 条件下进行电沉积80 s。对交流电（CV）来测定评估电沉积的效率，然后对Au NPs修饰后的SPCE和仅仅活化的SPCE做对比。最后FESEM证实了Au NPs在SPCE是沉积下来了。

    1. Au NPs/SPCEs表面的适配体固定

通过用固定接受生物来进行电极表面的修饰，在25度，10 mM的TCEP溶液内把PSA适配体溶液还原1小时用来打破二硫键。还原之后将PSA适配体溶液按1:20的比例和0.1 M PBS（pH=7.4）混合。接着把10 uL的适配体溶液滴入用Au NPs修饰过的SPCE中，在4度黑暗下放置12 h，这样就形成了我们要的自组装单层膜（SAM）。结束了之后这样的SPCE用超纯水冲洗确保移除任何多余的适配体。剩余的活跃位用MCH溶液来垫补。30 mins后继续用超纯水来清洗，并在氮气中干燥。

    1. PSA电化学测定

在用固定适配体修饰后的SCPE，修饰过电极（MCH/aptamer/Au/NPs/SPCEs）加入到不同浓度的PSA溶液中。在25度下静置45 mins后修饰电极用超纯水洗净后在氮气中干燥。将传感器加入到有[Fe(CN)6]3-/4-/KCl (5 mM /0.1 M) 的电解质溶液和0.1mPBS（pH=7.4）的电化学电池中。测定（PSA/MCH/硫代适配体/Au NPs/SPCEs）在-0.4 V～ 0.7 V每0.2 s 间隔，0.05的调制时间下的DPV信号。

表3.5ELISA和生物传感技术检测肿瘤标志物的比较

技术

传统方法（ELISA）

电化学适配体

生物识别组成

抗体昂贵

复杂反应器

需冷冻

适配体便宜

化学合成

室温

样品制备和试剂

有机溶剂消耗大

样本多，试剂用量大

有机溶剂消耗小

样本量小，试剂用量少

分析与应用

有经验丰富的人员的实验室

便携性和不需要经验

试验时间

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