羟丙基壳聚糖改性胶原蛋白肽制备和表征外文翻译资料

 2022-07-26 16:17:24

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羟丙基壳聚糖改性胶原蛋白肽制备和表征

摘 要

胶原肽（COP）可通过使用微生物转葡聚糖（PCA）转移到羟丙基壳聚糖（HPCS）上，谷胺酶（MTGase）作为生物催化剂。HPCS在碱性条件下由壳聚糖和环氧丙烷合成。衍生物的化学结构通过FT-IR和1H NMR光谱来表征。工艺条件从反应时间，反应温度，COP和MTGase与HPCS的质量比的摩尔比来优化。在本研究中，HPCS-COP可能不起作用，只有减少水分的损失，吸收水分的能力，即吸湿保湿能力与取代度（DS）值密切相关。此外，随着HPCS-COP的DS浓度增加，体内自由基清除活性增加，抗氧化活性增强。

1.介绍

皮肤是人体最大的表面积的一个充满活力的综合器官。它的正常功能可以通过许多因素逐渐削弱，比如老化，健康状况，环境污染物，它可能会受到包括慢性溃疡和烧伤在内的严重创伤的影响。有效的伤口敷料不仅能保护伤口免受周围环境的伤害还能提供持续组织重建的潮湿环境。生物材料的优势是形成自然的一部分组织矩阵,和一些积极参与正常伤口愈合和新组织的形成。这些生物材料包括胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、海藻酸盐、弹性蛋白。

壳聚糖作为一种天然的可再生资源,具有许多独特的性质,如生物相容性、生物降解性和无毒性。壳聚糖在许多领域有潜在的应用,如生物医药、污水处理、功能膜,食品、组织再生和化妆品及个人护理。由于其溶解度较低，壳聚糖的应用是有限的，羟丙基壳聚糖是一种重要的壳聚糖衍生物,它允许特定的化学修改伯胺基,这反应支持各种各样的正确嫁接官能团分子。最近，越来越多的实验结果已经表明了关于在伤口愈合和皮肤烧伤中使用壳聚糖的材料的潜在应用和开发。胶原蛋白是哺乳动物中最丰富的蛋白质，它是许多负重组织的主要组成部分，包括皮肤，韧带，肌腱和骨骼。基于胶原蛋白的材料具有生物相容性、可生物降解性和弱抗原性。由于其低抗原性和固有的生物相容性与大多数内生组织，胶原蛋白常被用于外科手术修复。在化妆品行业中，胶原蛋白也被广泛地用作水保湿剂和保湿剂。以胶原为基础的伤口敷料长期用于烧伤伤口和治疗溃疡。胶原蛋白肽作为功能成分水解胶原蛋白,它被公认为最有前途的一个生物材料在伤口愈合的应用程序。

作为一种生物催化剂,微生物转谷氨酰胺酶(MTGase)是一种胞外酶，具有显著特征的Ca2 有独立的催化性质,此外,其适合的温度和pH值范围大。MTGase用于催化大分子接枝和交联蛋白。MTGase能催化形成异构肽群gamma;酰胺类的谷氨酰胺残基(供体)和主胺或氨基酸群赖氨酸(酰基供体)。MTGase已被证明交联明胶胶原蛋白和大豆分离蛋白在组织工程和药物输送中的作用。

在这项研究中,MTGase被认为促进HPCS和胶原蛋白肽(COP)之间的反应,并对反应条件进行了优化。然后在不同的湿度下测量水分吸收和保留的能力。被用来评估HPCS-COP的抗氧化性能，氢氧自由基的清除效果和DPPH清除能力。此外,MTT试验评估了HPCS-COP对 NIH-3T3老鼠胚胎细胞的增殖的影响。

2．材料和方法

2.1材料

壳聚糖(CS) (520000 Mw) 92%程度的脱乙酰作用，金钟 (科钦、印度)。胶原蛋白肽(800 Mw) ，四川Mingrang生物科技有限公司，四川，中国，没有进一步净化。微生物转谷氨酰胺酶(MTGase) ，Huash生物科技有限公司,武汉,中国。氢氧化钠，异丙醇，丙烯环氧， 四甲基氢氧化铵氢氧根和其他化学物质（分析纯），蒸馏和去离子化水，国药控股集团化学试剂公司。

2.2制备HPCS

HPCS的准备基于之前的研究与轻微的修改。壳聚糖(20 g)被添加在碱性20毫升50%的氢氧化钠水溶液中，短暂时间内完全混合，保持在minus;18℃，24 h。待混合物解冻，然后转移到含有异丙醇200毫升的三颈圆底烧瓶中。大力搅拌30分钟后在室温下，添加2毫升25%四甲基氢氧化铵氢氧化物(TMAH)解决方案和添加200毫升氧化丙烯与搅拌1 h，然后连续搅拌，回流5 - 6 h与控温45℃。混合后过滤，然后用8000 - 10000年的透析分子量截止对蒸馏水透析管3天。最后，产品的获得是在干40℃真空24 h的条件，取代度是根据1H NMR确定的。

2.3净化MTGase

MTGase先投入到0.2 mol/L KH2PO4-NaOH缓冲溶液中(pH值6.5)。液体在每分钟4000转的速度下离心10分钟，使浮在表面的pH值调整到5.6（用1.0mol/L盐酸），除去不溶性组分后，上层清液的pH值调整到4.2（用1.0mol/L盐酸），然后离心。上层清液净化是通过透析8000-10000分子量截止透析3天。冻干MTGase24小时后得到的是冻干的MTGase。

2.4制备HPCS-COP

在一个典型的反应过程中,将准备好的HPCS（1g)和准备好的COP(1g)分别溶解在0.2 mol / L Na2HPO4 / NaH2PO4缓冲溶液中(PBS，pH值6.0)，直到他们在一起形成均匀溶液混合。MTGase粉(0.2 g)在PBS溶液溶解,添加到上述混合物中，在HPCS和COP之间形成催化反应。在40℃连续磁搅拌5 h。然后溶液在沸水中处理10分钟，之后冷却到室温。HPCS-COP解决方案与杯式超滤器过滤后得到。随后,解决方案是用20%氢氧化钠水溶液中和,、，然后纯化透析通过8000 - 10000分子量截止渗出油管3天。终于获得纯化HPCS-COP冻干透析产品。干产品存储在真空干燥器在P2O5进行进一步分析。合成HPCS-COP的过程是方案1。

2.5准备HPCS-COP的优化反应条件

四个独立变量进行调查,包括反应时间(1、2、4、5、6小时), 反应温度(30 – 70℃),COP和HPCS的质量比(0.8,1.0,1.2,0.8和1.0)和MTGase与HPCS的质量比(0.1、0.15、0.2、0.25和0.3)。因为变量被固定为一个,而只有一个变量值的变化。

2.6导数的描述

2.6.1傅里叶转换红外光谱(ir)分析

HPCS-COP傅立叶变换红外光谱,HPCS的那些时光5700和CS样本进行Nicolet傅里叶变换红外光谱仪(美国)的波数从400到4000厘米minus;1。样本由溴化钾磁盘的方法获得。

2.6.2 1H NMR表征

CS的1H NMR光谱及其衍生物被记录在一个力量amx-500核磁共振谱仪中。样品溶解在1% DCl D2O和 D2O中。四甲基硅烷(TMS)被用来作为内部标准。

2.6.3取代度测量

取代度(DS)被定义为组胺取代的数量每重复结构单元的HPCS。在这项工作中，DS是根据风扇的方法来测量的。COP的浓度在0.001 g / L和0.02 g / L是衬在200纳米的紫外线分光光度计与吸光度的关系。而班轮关系的标准曲线被描述为Eq。HPCS和HPCS-COP也测量在200纳米的紫外线分光光度法与吸光度与浓度的0.02 g / l。hpc的样本是空白控制。HPCS-COP的DSs是由Eq曲线来决定的。

其中A是COP的吸光度，C是COP的浓度。

2.7水分吸收和保留试验

吸湿性测试前,样本在真空P2O5中干燥24 h。水的吸收能力是通过干燥样品重量增加的百分比来计算的(Ra)：

W0和Wn是前后样品的重量，测定条件是饱和(NH4)2 SO4干燥器(81%相对湿度)和在饱和K2CO3干燥器(相对湿度43%)在20℃ 48 h。在肌肤保水测试中, 通过给每个样品添加10%的水来制备湿样的样品。

moisturere-tention能力评估是由残余水湿样品的百分比(Rh)测得的:

H0和Hn是之前和之后的水样本的权重，测定条件是硅胶和饱和K2CO3干燥器(43% RH)在20℃ 48 h。

2.8抗氧化性能

2.8.1羟基自由基清除活性

氢氧自由基的清除活动HPCS-COP是李测量的方法等。在这个系统中，羟基自由基是由Fenton的反应产生的。氢氧自由基氧化价成Fe3 ,只能结合1价,10邻二氮杂菲形成一个红色的化合物(1,10-phenanthroline-Fe2 )与最大吸光度在536nm。氢氧自由基的浓度是反映的程度的脱色反应的解决方案。快速将1，10-phenanthroline(1.0毫升，1.5毫米)和样品(1.0毫升)添加到一个螺旋帽管有序和混合均匀。 (1.0毫升，1.5毫米)然后用移液器吸取的混合物。反应是由添加1.0毫升过氧化氢(0.03%)。然后孵化37℃ 1h, 该反应混合物的吸光度是536纳米，而试剂是空白的。没有任何抗氧化剂的反应混合物被用作负控制(An)，没有使用过氧化氢作为空白(Ab)，羟基自由基清除活性(HRSA)是由以下公式计算：

2.8.2 DPPH自由基清除活动

样本混合1:1，0.1毫米DPPH的无水乙醇。在25℃在黑暗中孵化后30分钟，DPPH自由基的减少是由测量吸光度与紫外分光光度计在517nm，DPPH自由基清除活性HPCS-COP计算根据以下方程:

A,A0和Arsquo;分别为实验组,对照组和空白组。

2.9细胞培养的小鼠胚胎细胞NIH-3T3

2.9.1细胞培养和样品制备

NIH-3T3老鼠胚胎细胞培养使用杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM、高葡萄糖,HyClone)补充10%胎牛血清和包含100 u /mL青霉素抗生素，细胞重新培养在湿润的气氛中含5%二氧化碳在37◦C和媒介每2-3天。指数增长的细胞分离与0.25%胰蛋白酶，然后重新种植在新鲜培养基来创建一个新的细胞悬液接种。

2.9.2 MTT试验

通过MTT的分析检验了细胞短暂的生存能力，NIH-3T3细胞以96-6000的密度被播种到在DMEM补充微量滴定板10%的FBS中。在24小时的孵化后，细胞被用磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗，并添加了新的培养基。然后，在每个井中加入不同参数的PBS溶解的样品。在PBS的作用下，PBS的作用是控制组。在22小时的孵化之后，细胞被洗了两次，细胞信息也被更新了。然后MTT方法在PBS(5毫克/毫升)被添加到每个盘子,孵化为4 h 37℃，紧随其后的是删除介质和添加二甲亚砜(DMSO)对每个溶解甲瓒晶体。在约10分钟的震动后，可溶解的溶液变得均匀。光密度(OD)在490 nm用标仪测量。计算单元的存活率是通过以下公式计算的：

在OD样本获得HPCS-COP的存在,OD控制是在HPCS-COP缺席的情况下获得的。

3结果与讨论

3.1结构测定

3.1.1傅立叶变换红外光谱

计算机科学的傅立叶变换红外光谱(DD = 92%),COP和HPCS-COP是图1所示。CS的主要吸收带(图1)是1030cmminus;1(C=O伸缩振动3-OH),1160cmminus;1(C=O伸缩振动6)和1601cmminus;1(NH2)。

而在HPCS的傅立叶变换红外光谱(图1 b)，新的特征峰在2972cmminus;1和1378cmminus;1，这归因于C-H甲基组的拉伸和弯曲，此外, 壳聚糖的特征吸收峰在1030cmminus;1和1160cmminus;1，由于新的复杂结构导致的新信号，指示交联反应发生在6和3的壳聚糖。显然，典型的酰胺I和II是在1653cmminus;1和1544cmminus;1观察光谱的HPCS-COP(图1 c)。它表示NH2的酰胺键的形成。傅立叶变换红外光谱给出一个HPCS-CO化合的证据。

3.1.2 1H NMR表征

图2展示了1H NMR谱的CS，COP，HPCS-COP。CS的质子赋值如下: 1.91 ppm(CH3 acetamido基团),1.91 ppm(CH，C-2氨基葡萄糖环), 3.59 ppm(CH，C-2氨基葡萄糖环的取代氨基集团)，3.7 - -3.9 ppm(CH、N- 3、4、5和6氨基葡萄糖环)，4.73 ppm(CH，N- 1氨基葡萄糖环)[30]。特征质子HPCS出现在赋值的0.99 - -1.02 ppm(CH3 C-9)，表明壳聚糖的化合取代，特征的质子信号HPCS-COP(图2 c)出现在5.36 ppm(CH，c - 2)，表示旋转构象的存在，因为在N个键上有阻碍旋转的情况，这证明HPCS-COP的成功合成。以1H核磁共振分析为基础，对每一种糖渣中羟基丙基的平均数目进行了计算。DS的值可以用下面的公式来计算：

IH9和IH2-8 C-9氢的吸收强度和氢在8C-2,分别。DS-HPCS是1.3。

3.2合成HPCS-COP的优化反应条件

3.2.1反应时间对DS的影响

图3表明HPCS-COP DS的增加从0.22到0.34时，反应时间增加1 h - 5 h，然而，随着反应时间的进一步增加5 h - 6 h,DS略微下降至0.31。这可以解释如下:在第一阶段，时间越长反应时间提高HPCS和COP的扩散速度MTGase到活动中心。酶在5 h的基础上被基质所饱和，DS达到最高水平。然而，可逆反应随着反应时间的延长而加速。中间产物与H2O反应，而不是COP。这就导致了DS的出现减少。因此，它揭示了最佳时间是5 h和最高的DS 0.34

3.2.2反应温度对DS的影响

如图3所示(b)，DS增加从0.30到0.34之间的温度30和40℃，但40℃以上减少到0.21。可以看出温度影响着这些分子的运动。因此，随着温度的升高，反应物的活性和反应速率都在逐渐加快。但是，当温度达到时，DS会随着温度的升高而降低因为在较高的温度下酶的不激活。因为可逆反应加速，因为酶催化反应是放热反应。最佳温度是40℃。

3.2.3 COP与HPCS的质量比对DS的影响

根据图3(c)，DS增加0.8和1.2之间的比率。在较高的比例下，DS有急剧减少的趋势。根

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