羧甲基纤维素接枝胶原蛋白肽及其抗氧化性外文翻译资料

 2022-07-26 16:18:47

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羧甲基纤维素接枝胶原蛋白肽及其抗氧化性

摘要

用于创伤的羧甲基纤维素有着较弱的抗氧化能力。本研究的目的是提高羧甲基纤维素-胶原蛋白肽对自由基清除的能力。通过改变羧甲基纤维素-胶原蛋白肽的质量比、温度和反应时间来优化并确定了反应的最佳条件。羧甲基纤维素衍生物的抗氧化活性是通过对（DPPH）、羟基、超氧自由基的清除能力来评定的。分别测定了浓度、取代度（DS）和分子比重三种因素对自由基清除能力和还原能力的影响。采用噻唑蓝（MTT）法来测定羧甲基纤维素-胶原蛋白肽的细胞毒性。结果表明，羧甲基纤维素-胶原蛋白肽的清除作用随着取代度和浓度的增加而增加。说明本产品在自由基清除方面具有明显的抗氧化性。

1 绪论

羧甲基纤维素是水溶性的阴离子多糖和纤维素的半合成衍生物，它是由葡萄糖单元（AGU）在2、3与6位的羟基与氯乙酸纤维素反应得到的。羧甲基纤维素已经拥有非常广泛的应用，例如药物传递、纺织印染、造纸工业、医药、食品和伤口敷料等。因为羧甲基纤维素有着高吸水性、凝胶性、生物降解性和生物相容性。羧甲基纤维素要想作为伤口敷料提出了一些要求，如能够促进人成纤维细胞的增殖和黏附，流体具有高吸收性和持久性，不能破坏或损伤新形成的愈伤组织。羧甲基纤维素已被证明可以为伤口的愈合过程提供一个潮湿的最佳清创环境，归因于其吸水性和能直接进入其能力纤维的特性。对于伤口的治疗，也有必要降低蛋白酶和抑制高水平活性氧浓度的升高，以允许伤口得到较好的恢复。活性氧包括超氧化性的自由基（过氧根离子）、过氧化氢（H2O2）一 二羟基自由基等，都会对伤口的愈合产生很大的影响。过量的活性氧会导致细胞成分受到破坏，如DNA、脂质和蛋白质，也会对细胞外基质的成分造成破坏，如胶原蛋白，肽聚糖和透明质酸。人们相信，只有当生理环境达到平衡时，伤口才会痊愈。因此，必须降低伤口恢复过程中伤口内高活性氧的含量。早期的研究羧甲基纤维素对ROS的抗氧化能力不大。我们的目标是提高羧甲基纤维素在创面处理过程中的自由基清除能力。因此，我们合成了一种用胶原蛋白肽修饰羧甲基纤维素的衍生物。胶原蛋白肽具有多种生理功能，如低抗原性、趋药性、修复细胞和增进细胞活力、抵抗活性氧自由基等生理功能。胶原蛋白肽已被用来修改一些具有亲水性和生物相容性的材料，如聚乙烯和聚丙烯。在本文中用胶原纤维修饰的羧甲基纤维素来提高产品抗氧化活性的能力。本论文主要的研究和讨论了不同制备条件如反应温度、反应时间、反应物料比对胶原蛋白肽接枝羧甲基纤维素取代度的影响；分析了不同浓度、不同取代度和不同分子量的接枝产物对 DPPH、OH 和O2-自由基清除能力和还原能力的影响。

2 实验

2.1 材料

其中N-羟基琥珀酰亚胺 NHS）、2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和胶原蛋白肽（MW = 800）购买于中国武汉的华顺生物科技有限公司。羧甲基纤维素钠（分子量为7.8times;103）、铁氰化钾、邻菲罗啉，FeSO4·7H2O和H2O2·K3Fe（CN）购买于中国上海国药集团化学试剂有限公司。所有其他试剂为分析纯，并没有进一步纯化。

2.2 羧甲基纤维素衍生物的合成

先将 50ml (0.2mol/L) 的 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES，pH6.5）缓冲溶液加入三口烧瓶中，然后称取 0.6g 的羧甲基纤维素钠粉末加入烧瓶中，机械搅拌一段时间，使其充分分散并溶解至透明状态。待羧甲基纤维素完全溶解后，加入 0.38gEDC 和 0.11g NHS 对上述溶液进行活化，反应温度设定为 25℃，搅拌活化时间为 1h，然后加入适量的胶原蛋白肽粉末，继续加热搅拌 20h。反应完全后将溶液透析三天除去杂质，再旋转蒸发仪浓缩、恒温干燥箱干燥，即可获得胶原蛋白接枝羧甲基纤维素衍生物。

2.3 取代度的测定

取代度（DS）被定义为碳水化合物甲基纤维素骨架上每一个重复结构单元上羧基基团取代的数目。在这项工作中，集中紫外分光光度法在0.001 g/L和0.05 g/L之间的胶原蛋白肽与吸光度在200 nm呈线性关系。线性关系以公式（1）为例。羧甲基纤维素-胶原蛋白肽的取代度是公式（2）。

A= 25.322c 0.0097

R2 = 0.99979（1）

DS = 11350C/（800minus;39150 C）（2）

其中A为胶原蛋白肽的吸光度，C为浓度

2.4 羧甲基纤维素衍生物的降解

氧化降解方法被用来将产物降解为不同分子量的小分子。在水浴中进行氧化反应。之后完全溶解在蒸馏水中并使最终浓度达到2%（w / v），并将溶液预加热达到所需的温度，然后加入一系列不同体积的过氧化氢（30%）。之后，将溶液搅拌20min并在80℃的条件下消除残留过氧化氢。这个纯化产物经减压蒸馏、无水乙醇洗涤、冻干后得到冻干粉。

2.5 傅立叶变换红外光谱（FT-IR）分析

将羧甲基纤维素及羧甲基纤维素-胶原蛋白肽在恒温干燥箱中充分干燥后，研磨成粉末。采用压片法将样品压制成透明状圆片，透明圆片样品在红外波长为400-4000 cm-1范围内进行扫描，用溴化钾作为参比物质，将扫描得到的数据用红外软件处理即可得到样品的傅里叶红外光谱图。

2.6 光散射测量

羧甲基纤维素-胶原蛋白肽的重均分子量采用静态光散射仪测定。将待测样品溶于氯化钠水溶液 （0.1 mol/L） 中配成不同浓度的样品溶液， 将样品放入0.22 mu;m的微孔过滤器中，对其进行过滤处理。在25℃温度下，用光学折射仪测定折光指数n，波长设定为632.8nm，可得折光指数增量(dn/dc)。以10度为扫描间隔量，在角度范围为30-150度内进行散射光强扫射。

2.7 抗氧化能力的测定

2.7.1 DPPH自由基清除活性

根据 Wang Bin 等所使用的实验方法来测定样品对 DPPH 自由基清除的能力。量取 1.5 ml 不同浓度的样品溶液，然后与 1.5 ml 含 DPPH 的 95%乙醇溶液混合，混合溶液在室温无光环境下培养 30 min, 然后测量其在 517 nm 处的吸光度。对照组用乙醇代替混合液中的样品，空白组用乙醇代替混合液中的 DPPH 溶液。按公式计算样品对 DPPH 自由基清除的能力。其中 A0是对照组光度，A1是空白组吸光度。

DPPH自由基清除率（%）=（A0-A A1）/A0*100%

2.7.2 CMCC清除OH自由基能力的测定

羧甲基纤维素-胶原蛋白肽对羟自由基的清除能力是根据 Li zhongrui 等所报道的方法来测定。在这个体系当中，通过 Fenton 反应来产生羟基自由基。该反应的原理是，羟基自由基能将 Fe2 氧化成 Fe3 ，并且只有 Fe2 与 1,10-菲啰啉结合，才能形成红色络合物，该络合物在 536 nm 处有最大紫外吸收。羟基自由基的浓度大小是由测试溶液的脱色程度来体现的。实验方法简要如下：1.0mL1,10-菲啰啉（1.5 mmol/L）和 1.0 ml 样品一起加入到烧杯中并混合均匀。然后用移液管向混合物中加入 1.0 mL 硫酸亚铁溶液 （1.5 mmol/L），混合均匀后，将 1.0 ml过氧化氢溶液（0.03%v/v）加入到混合液中，反应开始进行。混合液在水浴中保温 1h，温度设定为 37℃，然后将紫外分光光度计波长设定为536nm，在该波长下测量混合液的吸光度。其中，As 为含有待测样品的吸光度，An 为用蒸馏水替代混合物样品的吸光度，作为阴性对照。Ab是用蒸馏水替代 H2O2的混合液吸光度，作为空白对照。由以下公式来计算OH清除能力：

羟自由基清除率(%)=（As-An）/（Ab-An）*100%

2.7.3 羧甲基纤维素-胶原蛋白肽清除O2自由基能力的测定

超氧自由基清除率的测定参考任俊凤等实验方法。羧甲基纤维素以及羧甲基纤维素-胶原蛋白肽对O2自由基的清除能力，通过邻苯三酚自氧化方法来测定。先配置好50mmol/L的pH8.2的Tris-HCl溶液，然后量取4.5ml上述溶液加入烧杯中，再加入1.0mL不同浓度样品的溶液，混合液在25℃下保温反应15min。保温结束后，迅速将0.5ml5mmol/L的邻苯三酚溶液加入，充分摇匀后放入比色皿中，在波长326nm处测量吸光度，每隔30秒记录一次吸光值，共计测量8次。以同样量的10mmoL/lHCl代替邻苯三酚，作为调零，用同样量的去蒸馏水代替样品溶液，作为空白。在320 nm 处分别测量含样品以及蒸馏水的邻苯三酚溶液随时间变化的吸光度，并将其绘制成曲线图，拟合得到线性回归方程，曲线斜率代表样品和空白的氧化速率。由以下公式计算超氧自由基清除率。

超氧自由基清除率=（H0-H）/H0*100%

2.7.4 羧甲基纤维素-胶原蛋白肽还原能力的测定

样品的还原能力是根据Wu等所报道的方法来测定的。2.0ml样品溶液和2.5ml1%的铁氰化钾溶液混合均匀，在50℃下保温30min后，加入1.5ml10%的三氯乙酸溶液。充分混合后，取2.0ml上层液，2.0ml蒸馏水，0.5 ml0.1%的三氯化铁溶液混合均匀，测量最后溶液在700nm处的吸光度。

2.8 MTT法评价细胞毒性

根据Zhu等研究用的实验方法，将待测样品溶解在杜氏磷酸缓冲液(DPBS)中形成不同的浓度，然后用纳米级过滤器进行灭菌。将加有100微升(80000个/ml)成纤维细胞液体的96孔培养板放在CO2浓度为5%的培养箱中培养。培养24h后，细胞用PBS缓冲溶液清洗，再加入新的培养基。然后不同浓度的10微升样品溶液加入到各个孔板中，继续培养22 h，将10微升的MTT试剂加入到每个孔中，轻轻敲打孔板使试剂充分混合。在37℃下培养4 h后，用PBS(pH7.4)缓冲溶液轻轻洗掉没有溶解的MTT试剂和残留的样品。吸去清洗液后加入100微升的二甲基亚砜(DMSO)，振荡反应10min，使MTT甲瓒晶体充分溶解。在490nm处，用酶联检测仪测量孔板的吸光度。按公式(2-5)计算细胞存活率，其中[OD]test为测试样品的吸光值，[OD]control为空白对照吸光值。平均值为标准偏差（n = 3）。

细胞存活率%=[OD]test/[OD]control*100%

3 结果与讨论

3.1 羧甲基纤维素衍生物的合成

改性羧甲基纤维素的合成工艺胶原蛋白肽如图所示。采用交联剂EDC的胶原蛋白肽氨基和NHS反应形成一个酰胺基羧甲基纤维素。通过改变工艺参数研究和讨论了不同制备条件如反应温度、反应时间、反应物料比对胶原蛋白肽接枝羧甲基纤维素取代度的影响，如图所示。在我们的实验设计中，以反应温度，胶原蛋白肽对羧甲基纤维素的反应质量比以及反应时间为工艺参数。因此，在本论文中各设置了5个反应温度（25，35，45，55，和65℃）、反应时间（12，16，20，24和28 h）和胶原蛋白肽对羧甲基纤维素的质量比（0.4 / 0.6，0.6 / 0.6，0.8 / 0.6，1 / 0.6）。

3.2 红外光谱

羧甲基纤维素、 羧甲基纤维素-胶原蛋白肽以及降解的羧甲基纤维素-胶原蛋白肽的红外图谱如图所示。羧甲基纤维素谱图上的宽峰 3434cm-1，归属于O-H键以及分子内和分子间氢键的伸缩振动。2922cm-1 吸收峰是 C-H 的反对称伸缩振动，而 1624cm-1 和 1422cm-1 处的两个吸收峰分别属于羧基的不对称和对称伸缩振动。对比羧甲基纤维素，羧甲基纤维素-胶原蛋白肽中出现了两个新的特征吸收峰，分别是 1651cm-1和 1548cm-1，归属于酰胺键的酰胺Ⅰ带和Ⅱ带，这两个吸收峰的存在证明了胶原蛋白肽接枝羧甲基纤维素的成功。另外，降解的羧甲基纤维素-胶原蛋白肽的红外图谱跟羧甲基纤维素-胶原蛋白肽图谱基本一致，酰胺键依然存在，说明双氧水的降解没有影响到接枝产物的主要结构。

3.3 反应温度对取代度的影响

从图可以看到温度对CMCC的取代度影响很大，随着温度从25℃增大到55℃，CMCC的取代度从0.15增大到0.57。当温度进一步升高，取代度随之下降，这是因为胶原蛋白肽接枝羧甲基纤维素是一个酰胺反应， 而酰胺反应是一个不断放热的过程，先期的升温是有利于提高反应物的活性和反应速率，反应朝着正向进行。当温度过高时，会使酰胺反应朝着相反的方向进行，从而导致取代度降低。所以，该反应的最佳温度为55℃。

3.4 反应时间对DS的影响

从图分析可以得到，羧甲基纤维素-胶原蛋白肽的取代度随着反应时间的增加先增大后减小。取代度的值在反应时间为 20 h 时达到最大，为 0.47。然而当反应时间进一步增加到 28 h 的时候，取代度逐渐下降，下降到最小为 0.35。适当延长反应时间有利于反应物的分散

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