一种由聚赖氨酸-接枝-甲基丙烯酰胺制成的光聚合的抗菌水凝胶涂层外文翻译资料

 2022-08-06 14:14:15

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一种由聚赖氨酸-接枝-甲基丙烯酰胺制成的光聚合的抗菌水凝胶涂层

摘要：

由聚赖氨酸-接枝-甲基丙烯酰胺(EPL-MA)制成的水凝胶已被发现，其具有令人印象深刻的广谱抗菌活性，可以杀死细菌(特别是大肠杆菌，铜绿假单胞菌，沙雷菌和金黄色葡萄球菌)和真菌(特别是白色念珠菌和腐皮镰刀菌)。该水凝胶还具有体外生物相容性，其溶液相对非溶血:人体红细胞(hRBC)溶血开始所需的浓度为12500 mg/mL，使病原微生物对hRBCs的选择性为230-1560。此外,该水凝胶可以很方便地被紫外线固定到等离子体处理过的塑料表面上从而为医疗器械和植入物形成薄的高附着性的抗菌水凝胶涂层。

1、引言：

与医疗植入有关的感染变得越来越普遍，并导致显著发病率，甚至导致死亡。最近，有很多努力克服植入相关感染的应用，包括在抗菌涂料的基础上的抗生素，抗菌化学品如银、抗菌肽(AMPs)、天然抗菌聚合物等。然而,由于抗生素,抗菌药品和化学药品的毒性和在病原体中产生耐药性的可能性会引起感染，所以它们的使用要谨慎。例如,在医院里耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染已成为一种常见病。另一方面，抗菌肽也可以高效防止医疗器械微生物植入，通常通过膜渗透引起细胞死亡病原体，所以很难对它们产生耐药性。然而，当它们作为涂层固定在表面时，许多抗菌肽有溶血性或毒性并损失了其效果。作为接触活性抗菌涂料的阳离子聚合物，如聚(乙烯基-正己基-吡啶)也被研究，它们通常具有较差的生物相容性、较高的毒性或较差涂覆性，使其不适合种植涂层。它们具有高广谱抗菌活性、生物相容性且易于使用的涂料配方，具有有限的可生物降解性和无毒性。

EPL是一种白色链霉菌，已被发现具有很高的抗菌性活性，尤指长度为10余位或以上的品级。EPL对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有活性如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、沙雷菌和金黄色葡萄球菌和真菌(如白色念珠菌)。EPL以与其他AMPs类似的方式杀灭微生物，即通过吸附在表面的微生物膜导致对细胞的生理损伤，使微生物不受影响很容易产生抗药性。与许多其他AMP不同，EPL可食用，无毒，可生物降解，并能以较低的成本生产。然而，到目前为止，这种材料主要被开发为抗微生物食品添加剂或溶液中的基因传递剂，而不是作为一种抗菌涂层材料。理想情况下，固定化不会妨碍其抗菌效果。

本文报道了一系列基于光可聚合、接触活性和无细胞毒性的环氧丙烷接枝甲基丙烯酰胺的纳米凝胶膜和涂层的高效广谱分析方法，例如CH2=C(CH3) CONH-EPL(以下称为EPL-MA)。EPL(Mn=3000)与甲基丙烯酸反应(MA)使用N-羟基丁二酰亚胺和N,N -二环己基碳二酰亚胺(DCC)生产EPL-MA聚合物。每个水凝胶含有10%的固体，这种EPL-MA，二甲基丙烯酰胺(DMA)单体和聚乙二醇双丙烯酸酯(PEGDA)交联剂的混合物分子量为700 Da)。水凝胶中EPL-MA的含量的变化范围为0、6.25%、11.8%、16.7%、21.1%-25%(其余部分由PEGDA和DMA组成，保持比例不变为2:1)(w/w)，分别标记为A0(对照)，A1, A2， A3、A4和A5。针对四种临床上重要的细菌(如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和两种真菌(即白色念珠菌)并对赤霉病菌，我们对EPL-MA的最低抑制浓度(MICs)和EPL-MA的杀死效能进行了评价。考察了水凝胶的溶胀能力和体外生物相容性，我们对EPL-MA溶液的溶血性和机械性能，也进行了研究。同时用扫描电子显微镜和活/死细菌测定法研究了EPL-MA水凝胶对细菌/真菌形态的影响。通过紫外线照射在聚合物圆盘上形成水凝胶涂层，说明了涂层过程的简易性。

2、材料和研究方法

2.1 材料

EPL-MA (通过透析纯化，Mn=3000，来自Handary生物工程，荷兰), N,N-二甲基甲酰胺(DMF, SigmaeAldrich)，甲基丙烯酸(MA, SigmaeAldrich)， N,N-二甲基丙烯酰胺(DMA, SigmaeAldrich)，聚乙二醇丙烯酸(Mn=700,SigmaeAldrich).

2.2 甲基丙烯酸改性EPL

将0.63 g (7.34 mmol)甲基丙烯酸(MA)和0.93g (8.1 mmol) N -羟基琥珀酰亚胺(HOSu)溶于10ml DMF中。1.51 g (7.34 mmol)溶解在 10 mL DMF的DCC在持续30分钟里逐渐加入 MA/HOSu 溶液中，然后在0℃保持2 h后，在室温下搅拌4 h。对混合物进行过滤，得到的溶液加入EPL溶液中(20 g， (6.67 mmol)溶于水/DMF (200 mL: 100 mL)中，搅拌24小时。反应结束后，用旋转蒸发器浓缩溶液，在丙酮中沉淀过滤。本品溶于100ml 水中，过滤掉不溶性粉末。该溶液在去离子水中透析2天，在真空中蒸发，在40℃的真空中干燥一夜，产率gt; 80%。

在Bruker DMX-3000上记录了以D2O为溶剂的分光计的EPL和EPL- ma的1H NMR谱。EPL的平均分子量为从图1A计算到3000。最小抑菌浓度采用标准微量稀释法测定LB媒介。用人红细胞进行溶血试验。

2.3 溶液MIC及溶血试验

采用二倍法制备了一系列多肽(EPL和EPL- ma)溶液，在LB培养基中稀释2000 mg/mL缩氨酸至最终缩氨酸浓度为1000-1mg /mL。然后从该系列中各稀释100毫升肽，稀释后加入96孔组织培养聚苯乙烯(TCPS)板。在那之后,每孔加入100 mL LB溶液中的细菌悬浮液，形成最终溶液，微生物浓度为105 CFU/mL。96 孔板在37℃孵化18 h .MIC是最低的抗菌材料的浓度，可以抑制微生物细胞生长的一个特定的时间。这个测试被独立地重复了两次。

在Tris 缓冲区(pH 7.4)中， 37℃时，用不同浓度的肽(EPL或EPL-ma)孵育人类血液细胞 (5%, v/v) 1 h，然后将试管离心。上清液在540nm处进行吸光度值分析。以0.1% Triton X-100裂解为阳性对照。EPL和EPL- ma的溶血值(H)计算公式如下:H=100（AP-AB）/(AR-AB),其中AP为肽溶液的吸光度，AB为缓冲液的吸光度，AR为吸光度0.1% Triton X-100。

2.4 水凝胶的制备

采用EPL-MA、PEGDA和DMA共混的方法制备了一系列水凝胶。以EPL-MA-25为例，加入DMA (0.2 g)和PEGDA (0.1 g)(Mn = 700)，再加入水(3.6 mL)和水溶性光引发剂Irgacure 2959(0.05%)，得到EPLMA -25(即含EPLMA (0.1 g)，占固体含量的25%)。将水凝胶前驱液(10%重量的固体，90%的水)倒在水平的玻璃板上。然后将混合物暴露在UV汞灯下25分钟。

2.5 水凝胶的特性

使用Instron 5543单柱测试系统对膨胀凝胶进行了水凝胶的压缩性能测试。水凝胶样品在测试前用锋利的刀水平切片，以获得平整的表面。凝胶以0.5 mm/秒的应变率被压缩。杨氏模量由应力-应变曲线在0-20%范围内的平均斜率决定。每个样本进行10次平行测量，取平均值。

在吸水研究中，将UV交联水凝胶在去离子水中冲洗48小时，将水凝胶从水中取出，用吸水纸擦拭表面后称重。重复肿胀过程，直到没有体重增加。吸水率计算为：（吸水率=水凝胶的重量-聚合物干重）/聚合物干重*%

为了进行水凝胶的抗菌活性测试，对各种水凝胶进行了清洗，用去离子水浸泡两天。细菌在LB中培养24小时，接着离心，然后用磷酸盐即缓冲盐水(PBS, pH 7.2)清洗;再悬浮、离心、洗涤重复三次。将菌悬液(每10ml)移入PBS，以水凝胶薄膜为中心，在聚苯乙烯板孔中进行组织培养。细菌悬浮液与水凝胶在24℃保持接触2小时。然后在盘子里加入少量的LB，收集任何存活的细菌。细菌数量由使用Luria-Bertani琼脂平板进行一系列稀释(10倍)，在35℃下培养48小时，计算结果为:缩减数=日志(控制的初始计数)-日志(暴露时间为2小时的幸存者数)

采用A2水凝胶和A0对铜绿假单胞菌的存活/死亡进行了研究。细菌细胞在LB和P. aeruginosa中培养过夜，在37℃下悬挂在PBS分散表面1h，然后用碘化丙啶和碘化丙啶两种染料对样品进行染色，随后用蔡司倒置光学显微镜对样品进行分析，该显微镜配有荧光素和罗丹明滤光片。

为了研究微生物形态，在10ml菌剂上喷1.5cm*1.5cm的EPL-PEG-DMA水凝胶和PEG-DMA水凝胶并在35℃下孵化2 h。然后立即用5毫升2.5%戊二醛固定4小时，在分级乙醇(20-100%)中脱水。采用场发射扫描电镜(FESEM, JEOL JSM-6700F)对冻干水凝胶进行了微生物形态变化的表征。

2.6 水凝胶涂层和表征

采用等离子体-紫外引发的表面接枝聚合方法，在富马酸酯氟烷基(含硅烷基)共聚物圆盘表面固定聚乙二醇-甲基丙烯酸酯(EPL-MA)水凝胶。采用射频(RF, 13.56 MHz)氩气等离子体(March PX-500)预处理50 W,100 sccm预处理60 s，暴露于大气中15 min。预处理后，将A5大分子单体溶液吸到表面，并覆盖聚酯膜(Melinex 453, DuPont)。将水凝胶前驱液通过聚酯薄膜进行交联(365 nm, 100 mW/cm2, 30 min)。交联并除去聚酯膜后，在超声浴中用去离子水彻夜冲洗，去除未接枝的低聚物或均聚物。

采用扫描电镜(SEM, JEOL JSM-6390LA)对固定化EPL水凝胶进行了表征。在光学显微镜下，用1%荧光素(钠盐)染色10分钟，然后用去离子水清洗1小时，这样的染色过程使涂层很容易被肉眼观察到。水凝胶涂覆塑料底物的抗菌活性测试遵循一种改进的标准方法(ISO 22196:2007E，塑料-塑料表面抗菌活性测定)。

2.7 水凝胶涂敷塑料圆盘的抗菌试验

细菌细胞在LB中培养过夜，1mL悬浮液离心，PBS洗涤3次。然后用PBS将菌悬液稀释至1ml。将10nl的细菌悬液添加到每个涂有水凝胶的塑料圆盘表面，然后用另一个圆盘覆盖，轻轻按压，使接种物覆盖整个圆盘表面。光盘在37℃、相对湿度不少于90%的环境下孵化24小时，加入2ml中稀释的细菌。存活下来的细菌溶液被稀释到不同浓度(10倍)。之后，我们将每个溶液100毫升放入LB琼脂中。然后在37℃下孵化该板1-2天并集落形成单位，每个浓度孵育3个平板。

3、结果

3.1 合成EPL-MA

EPL和EPL-MA的1H NMR谱图证实了MA的成功 (图1)。与EPL和EPL-MA的1H NMR谱相比，图1B中5.40 ppm和5.64 ppm的额外信号可以归因于双键上的两个氢甲基丙烯酰胺基团，表明酰胺化成功。

根据图1B计算酰胺化程度，从峰值8和9的比例达到峰值1为93%（=(峰8thorn;峰9)/峰1)。EPL的GPC分析表明，EPL的Mn=3550 Da，与NMR结果一致。

3.2 抗菌性能和选择性

表1为EPL和EPL- ma溶液的MIC值，对各种病原体的抵抗力都很低，一般低于100 mg/mL，说明EPL和EPL-ma溶液的含量都能很高效杀灭病原体。考虑到一些病原体，比如真菌很难杀死，这一点尤其令人印象深刻，结果还表明，三元乙丙醇的酰胺化反应不发生，对中等收入国家造成重大不利影响。EPL和EPL- ma有几乎相同的MIC是合理的，因为MA只是一个小MA-EPL链的一部分。

图2显示了在EPL和EPL- ma浓度为12500 mg/mL时的细胞(红细胞)，人类红细胞的零溶血， H50浓度(即引起50%红细胞溶血的浓度)两者均大于50000毫克/毫升，高于一般水平大多数其他抗菌肽和聚合物的价值(约500毫克/毫升)。

由表1可知，A1、A2、A5水凝胶膜均具有较高的对四种被测细菌的抗菌性，在2小时暴露期内杀死超过99%的细菌。A5的活性最高，抗所有病原体，这是由于其较高的EPL-MA含量。

将微生物接种于A2水凝胶上2小时，用扫描电镜(图3);以A0水凝胶为对照。与对照组相比，其形态与A2水凝胶接触的微生物发生了明显的变化。对细菌和真菌进行对照， A0水凝胶呈现光滑、圆润的状态，而 A2水凝胶呈现出皱缩的表面。用水凝胶A2对活/死铜绿假单胞菌进行细菌活力测定，以水凝胶A0为对照。通过这个实验，细菌细胞是绿色则是活的，而膜受损的红色的细菌细胞是死。由图4可知，铜绿假单胞菌在水凝胶A0上存活(对照)，但在水凝胶A2上死亡。

3.3 物理性质

从图2B可以看出，我们的A1到A5水凝胶总体上是高度吸水的，吸水率为1200-2400%。然而,这些水凝胶具有较高的抗压性能，杨氏模量为196至106 kPa，强度为81至40 kPa。

3.4 体外生物相容性

采用生物相容性评价方法评价了EPL-MA水凝胶的生物相容性，用文献中描述的方法进行细胞毒性试验。水凝胶(A2)直接作用于原发人表皮角质形成细胞，组织体外培养7天，以聚苯乙烯培养皿(TCPS)为对照。由图5A可知，与培养时间相比(虽然低于TCPS)，与A2水凝胶接触的细胞的MTT吸光度增加，表明细胞在A2的存在下增殖水凝胶。在图5

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