一种光聚合抗菌水凝胶涂层ε-聚赖氨酸外文翻译资料

 2022-08-06 14:14:22

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一种光聚合抗菌水凝胶涂层ε-聚赖氨酸

研究发现由ε-聚-L-赖氨酸接枝甲基丙烯酰胺（EPL-MA）制成的水凝胶对细菌（特别是大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌和金黄色葡萄球菌）和真菌（特别是白色念珠菌和茄枯萎菌）具有抗菌活性。EPL-MA水凝胶还具有体外生物相容性，且EPL-MA溶液相对不溶血：人的红细胞（hRBC）开始溶血所需浓度为12500 mg/mL，因此对hRBC上的病原微生物的选择性为230-1560。此外，EPL-MA水凝胶可以紫外线固定在等离子体处理过的塑料表面上，以形成用于医疗器械和植入物的薄高粘附性抗菌水凝胶涂层。

1.介绍

与医疗植入物相关的感染正在变得越来越普遍，并导致严重的发病率，在某些情况下，甚至死亡。近年来，人们通过使用抗菌涂料、抗菌化学物质如银、抗菌肽（AMPs）、天然抗菌高分子等，努力克服与植入物相关的感染。然而，由于抗生素、抗菌药物、化学品的毒性和在病原体中可能产生耐药性，应谨慎使用。例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染已成为医院常见问题。另一方面，AMPs对于防止微生物在医疗器械上定植也非常有效，它通常通过膜渗透导致细胞死亡，因此病原体很难对其产生耐药性。然而，许多AMPs具有溶血性和/或毒性，当它们作为涂层固定在表面上时会失效。阳离子聚合物如聚（乙烯基-正己基-吡啶）也被用作接触活性抗菌涂层，但它们通常具有生物相容性差、毒性高和/或可涂层性差的特点，因此不适合用于种植体涂层。具有广谱抗菌活性、生物相容性好、使用方便、可生物降解、无毒的涂料配方受到限制。

ε-聚-L-赖氨酸（EPL）是一种典型的由白链霉菌（Streptomyces albulus）产生的AMP，具有很高的抗菌活性，尤其是它含有十个或十个以上的残基。EPL对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌（如大肠杆菌（E.coli）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）、粘质沙雷氏菌(S. marcescens)和金黄色葡萄球菌（S. aureus））和真菌（如白色念珠菌（C.albicans））均有效。EPL以与其它AMPs相似的方式杀死微生物，即吸附在微生物膜的表面，损伤细胞生理，从而使微生物不易产生抗药性。与许多其他AMP不同，EPL是可食用的、无毒的、可生物降解的，并且生产成本低。然而，到目前为止，这种材料主要用作抗菌食品添加剂或基因传递剂，以溶液形式存在，而不是作为抗菌涂层材料。理想情况下，固态不会妨碍其抗菌效果。

本文报道了一系列基于光聚合的高效广谱抗菌水凝胶膜和涂层，活性接触和非细胞毒性的EPL接枝甲基丙烯酰胺，即 CH2=C(CH3)CONH-EPL（以下简称EPL-MA）。以N-羟基丁二酰亚胺（HOSu）和N，Nrsquo;-二环己基碳二亚胺（DCC）为原料，与甲基丙烯酸（MA）反应制备EPL-MA聚合物。每种水凝胶含有10%的固体，是EPL-MA、二甲基丙烯酰胺（DMA）单体和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）交联剂（分子量为700Da）的混合物。水凝胶前驱体（固体）中EPL-MA的含量分别为0、6.25%、11.8%、16.7%、21.1%-25%（其余为PEGDA和DMA，比例为2:1）（w/w），样品分别标记为A0（对照）、A1、A2、A3、A4和A5。观察EPL-MA水凝胶对4种临床重要细菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粘质链球菌、金黄色葡萄球菌）和2种真菌（白色念珠菌和枯萎病菌）的最低抑菌浓度（MICs）和杀灭效果。研究EPL-MA溶液的溶血活性、凝胶的力学性能、溶胀性能和体外生物相容性。用扫描电镜（SEM）观察与EPL-MA水凝胶接触的细菌/真菌的形态变化，并进行活菌/死菌检测。通过UV辐射在聚合物圆盘上形成水凝胶涂层，证明涂覆过程的容易性。

2.材料和方法

2.1材料

ε-聚-赖氨酸（透析纯化，Mn=3000，来自荷兰生物工程）、N,Nrsquo;-二环己基碳二亚胺（DCC，西格玛·奥尔德里奇）、N-羟基琥珀酰亚胺（HOSu，西格玛·奥尔德里奇）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，西格玛·奥尔德里奇）、甲基丙烯酸（MA，西格玛·奥尔德里奇）、N,N-二甲基丙烯酰胺（DMA，西格玛·奥尔德里奇）、聚（乙二醇）二丙烯酸酯（PEGDA，Mn=700，西格玛·奥尔德里奇）。

2.2甲基丙烯酸改性EPL

将0.63g（7.34mmol）甲基丙烯酸（MA）和0.93g（8.1mol）N-羟基琥珀酰亚胺（HOSu）溶解于10ml DMF中。将溶解于10ml DMF中的1.51g（7.34mmol）DCC逐渐加入MA/HOSu溶液中持续30min，在0℃下保持2h，后在室温下搅拌4h。过滤混合物，将所得溶液加入到溶解于水/DMF（200 mL:100 mL）中的EPL溶液（20 g（6.67 mmol）中并搅拌24小时。反应结束后，用真空旋转蒸发器浓缩溶液，在丙酮中沉淀并过滤。将产品溶解在100毫升的水中，并过滤以去除未溶解的粉末。将溶液在去离子水中透析2天，真空蒸干，然后在40°C的真空中干燥过夜（收率gt; 80％）。

以重水为溶剂，在Bruker-DMX-3000谱仪上记录EPL和EPL-MA的核磁共振氢谱。根据图1A计算出EPL的平均分子量（Mn）为3000。在Luria-Bertani肉汤（LB）培养基中，通过标准微量滴定稀释法确定最小抑制浓度（MIC）。还进行了使用人红细胞的溶血测定。

2.3溶液MIC和溶血试验

通过在LB培养基中对2000mg/mL的肽原液进行二倍稀释，制备了一系列肽（EPL和EPL-MA）溶液，最终的肽浓度为1000-1mg/mL。然后从系列稀释液中提取100毫升稀释肽，加到96孔组织培养聚苯乙烯（TCPS）板中。之后，将100 mL LB溶液中的细菌悬浮液添加到每个孔中，以形成105 CFU / mL的最终微生物浓度。随后将96孔板在37℃下保温18小时。对于真菌病原菌，生长培养基为添加2%葡萄糖的RPMI1640，28℃孵育48小时。 MIC是最低的抗菌材料浓度，可在一定时间后抑制微生物细胞的生长，该试验单独重复两次。

将不同浓度的肽（EPL或EPL-MA）与人类血细胞（5％，v / v）在Tris缓冲液（pH 7.4）中于37°C孵育1小时。在540nm处分析上清液的吸光度值。以0.1%Triton X-100为阳性对照，EPL和EPL-MA溶血值（H）的计算公式如下：

其中AP为肽溶液的吸光度，AB为缓冲液的吸光度，AR为0.1%Triton X-100的吸光度。

2.4水凝胶的制备

通过混合EPL-MA，PEGDA和DMA制备了一系列水凝胶。配置过程的一个例子：为了制备EPL-MA-25（即固相含量为25 wt%的EPL-MA（0.1 g），DMA（0.2 g）和PEGDA（0.1 g）（Mn=700）），随后添加水（3.6 mL）和水可溶性光引发剂Irgacure 2959（0.05%）。将水凝胶前体溶液（10 wt%固体，90%水）倒入水平玻璃板上。然后将混合物暴露于紫外线汞灯下（Honle紫外线技术机，365 nm，25 mW/cm2，15分钟）。每个系列的水凝胶都是以类似的方式制备的。

2.5水凝胶的表征

利用Instron 5543单柱测试系统对膨胀凝胶进行了压缩性能测试。水凝胶样品在测试前用一把锋利的小刀进行水平切片，以获得平坦的表面。以0.5mm /秒的应变速率压缩凝胶。

在水凝胶抗菌活性试验中，用去离子水冲洗水凝胶两天。细菌在Luria Bertani肉汤中培养24小时，收集并离心，然后用磷酸盐缓冲盐（PBS，pH =7.2）洗涤；再悬浮、离心和洗涤重复三次。将PBS中的细菌悬浮液（各10 mL）转移至组织培养聚苯乙烯平板孔中水凝胶膜的中心。细菌悬浮液在24°C下与水凝胶接触2小时（“暴露时间”）。然后将少量的Luria Bertani肉汤添加到板孔中，以回收所有存活的细菌。用Luria-Bertani琼脂平板，用10倍稀释法测定细菌数，35℃培养48h，计数菌落形成单位。计算结果如下：减少量=控制的初始计数-暴露时间为2小时的幸存者计数。

研究A2水凝胶和A0水凝胶（对照）对铜绿假单胞菌活/死的影响。将细菌细胞在LB中培养过夜，铜绿假单胞菌悬液在37℃下分散于水凝胶表面1h。之后，用染料（碘化丙二钠和SYTO 9）对样品进行染色。随后，随后，通过装有荧光素和若丹明滤光片的蔡氏倒置光学显微镜对样品进行分析。为了进行微生物形态学研究，将10 mL接种物喷洒在1.5 * 1.5 cm EPL-PEG-DMA水凝胶和PEG-DMA水凝胶（对照）薄膜上，并在35°C下孵育2小时。然后立即用5ml 2.5%戊二醛固定凝胶4h，并在分级乙醇系列（20-100%）中脱水。采用场发射扫描电子显微镜（FESEM，JEOL-JSM-6700F）对冻干水凝胶的微生物形态变化进行了表征。

2.6水凝胶涂层及其表征

通过等离子-紫外线诱导的表面接枝聚合两亲性聚降冰片烯衍生物，将EPL-MA水凝胶固定在富马酸氟烷基（含硅烷基烷基酯）共聚物盘的表面上。通过射频（RF，13.56 MHz）氩气等离子体（March PX-500）在50 W，100 sccm的压力下对磁盘进行预处理60 s，然后将其暴露在大气中15分钟。预处理后，用移液管将A5大分子单体溶液移到表面并覆盖聚酯薄膜（Melinex 453，杜邦）。水凝胶前驱体溶液通过聚酯薄膜经紫外线照射（365nm，100mw/cm2，30min）交联。在交联和去除聚酯膜后，用过量去离子水在超声波浴中漂洗一夜以去除未接枝低聚物或均聚物。

采用扫描电镜（SEM，JEOL-JSM-6390LA）对固定化EPL水凝胶进行了表征。在光学显微镜下，用1%荧光素（钠盐）染色10分钟，然后用去离子水冲洗1小时，使涂层易于肉眼观察。对水凝胶涂覆的塑料基材的抗菌活性测试遵循改进的标准方法（ISO22196:2007E，塑料-塑料表面抗菌活性的测量）。

2.7水凝胶涂膜塑料盘的抗菌试验

细菌细胞在LB中培养过夜，取1ml悬液离心，用PBS洗涤3次，然后用PBS将细菌悬液稀释至1毫升。在每个涂有水凝胶的塑料圆盘表面加入大约10ml的细菌悬浮液，然后用另一个圆盘覆盖，轻轻按压，使接种物散布在圆盘的整个表面上。将圆盘在37°C下、相对湿度不少于90％的环境中孵育24小时。孵育后，将2 mL中和肉汤添加到平板中以稀释存活的细菌。 然后将存活的细菌溶液稀释至不同浓度（10倍）。之后，我们将每种溶液取100ml装在LB琼脂中，然后在37℃下将平板孵育1-2天，并计数菌落形成单位，每个浓度孵育三个板。

3.结果

3.1 EPL-MA的合成

EPL和EPL-MA的核磁共振氢谱证实了MA的成功修饰（图1）。比较EPL和EPL-MA的核磁共振氢谱，图1B中5.40和5.64ppm处的附加信号可归因于甲基丙烯酰胺基双键上的两个氢，表明酰胺化成功。从图1A中的峰2与峰1的比值知，EPL的分子量计算为3015（=128*（峰2/峰1） 1）Da。根据图1B中的峰8和9与峰1的比率计算酰胺化程度为93%（=（峰8 峰9）/峰1）。EPL的GPC分析（支持信息）表明EPL的Mn=3550Da，证实了NMR的结果。

3.2抗菌性能和选择性

表1显示，EPL和EPL-MA溶液对各种病原体的MIC值非常低，通常小于100 mg/mL，表明EPL和EPL-MA溶液对病原体的杀灭都非常有效。考虑到某些病原体（例如真菌）通常难以杀死，这一结果尤其令人印象深刻。结果还表明，EPL的酰胺化对MICs没有明显的不利影响，EMA和EPL-MA具有几乎相同的MIC，这是合理的，因为MA只是MA-EPL链中的一小部分。

图2A显示，在EPL和EPL-MA浓度高达12500 mg/mL时，人红细胞（rbc）血溶度为零（H0 ）。两者的H50（即引起50%rbc溶血的浓度）均大于50000 mg/mL，高于大多数其他抗菌肽和聚合物（约500 mg/mL）的典型值。因此，EPL-MA的H0 /MIC选择性在230-1560范围内，高于许多报道的聚合物和肽的选择性（通常小于100）。

表1显示，A1、A2和A5水凝胶膜对4种被测细菌（大肠杆菌、铜绿假单胞菌、粘质链球菌、金黄色链球菌）均具有很高的杀灭活性，在暴露2小时内杀灭了99%以上的细菌（减少了2 log）。A5对所有病原菌的活性最高，这是由于其EPL-MA含量较高。

将微生物接种在A2水凝胶上2小时，并用SEM观察（图3）； A0水凝胶用作对照。与对照相比，与A2水凝胶接触的微生物的形态发生了明显变化。A0水凝胶上的细菌和真菌表面光滑、圆润，而A2水凝胶上的细菌和真菌表面皱褶、枯萎。以A0水凝胶为对照，用铜绿假单胞菌对A2水凝胶进行活/死细菌活力测定。通过这种分析，绿色的细菌细胞是活的，而红色的细菌细胞是死的，细胞膜受损。图4显示铜绿假单胞菌细胞在水凝胶A0（对照）上存活，但在水凝胶A2上死亡。

3.3物理性质

图2B显示，我们的A1至A5水凝胶通常高度膨胀，吸水量为1200-2400%。然而，这些水凝胶具有相当高的压缩性能，杨氏模量为196-106千帕，强度为81-40千帕（图2C和D）。

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