一种来自Aliivibrio salmonicida用于在碱性pH下生产戊二胺的新型赖氨酸脱羧酶的表征外文翻译资料

 2022-08-06 14:31:59

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一种来自Aliivibrio salmonicida用于在碱性pH下生产戊二胺的新型赖氨酸脱羧酶的表征

摘要：赖氨酸脱羧酶(LDCs)催化L-赖氨酸转化为戊二胺，戊二胺是生物基聚酰胺的高效的构建单元。由于经济和环境的问题，我们希望赖氨酸脱羧酶在较高pH下仍具有较高活性。在这项研究中，我们发现、表达并表征了一种来自Aliivibrio salmonicida的新型赖氨酸脱羧酶（AsLdc）。相较于来自于大肠杆菌（Escherichia coli）的赖氨酸脱羧酶Ldc和CadA，前者常被用于戊二胺的生产。纯化后的AsLdc在pH 7.0-8.5碱性环境下表现有更高的活性，例如在pH 7.5下使用10 mu;g/mL酶时，其活性为205.1 U/mg，而CadA和LdcC分别为68.3和51.5 U/mg。在pH范围为5.0-8.5时，AsLdc和CadA的活性与十聚体的比例密切相关。熔点为79°C的AsLdc比CadA（73.6°C）热稳定更好。当在pH 7.5下将赖氨酸全细胞生物转化为戊二胺时，AsLdc在7小时内完成了转化，而CadA仅完成了82.8％。这些结果表明，新型AsLdc在戊二胺的工业生产中具有很高的潜力。

关键词：赖氨酸脱羧酶 戊二胺 生物转化 表征 Aliivibrio salmonicida

1.背景介绍

赖氨酸脱羧酶（LDCs; EC 4.1.1.18）是催化L-赖氨酸脱羧形成尸胺（1，5-二氨基戊烷）的关键酶。这些酶需要5-磷酸吡哆醛（PLP）作为辅助因子使L-赖氨酸的alpha;-羰基脱羧。赖氨酸脱羧酶在细胞生长和耐酸反应中的作用已得到充分研究。到目前为止，已经纯化和鉴定了来自不同细菌（例如大肠杆菌，Hafnia alvei，伯克霍尔德菌，反刍支原体和副溶血性弧菌）的几种赖氨酸脱羧酶。例如，大肠杆菌具有两种类型的LDC诱导型CadA，也称为LdcI和组成型LdcC。Lane等人确定了使用非细胞提取物的CadA（pH 5.5; 52°C）和LdcC（pH 7.6; 52°C）的最佳pH和温度。Krithika等人纯化并表征了这两种酶，并且他们专注于CadA （Km：0.27 mM; Vmax：8.148 nmol尸胺/ min /mu;g）和LdcC（Km：0.84 mM; Vmax：27.21 nmol尸胺/ min /mu;g的动力学参数。

近年来，赖氨酸脱羧酶因其在生物合成尸胺中的应用而引起了人们的极大兴趣，尸胺是一种很有前途的聚酰胺（尼龙）生产的基本单元。生物聚酰胺具有较好的的力学性能，例如在某些方面，PA510甚至超过了商用PA6和PA66。来自可再生原料的生物基聚酰胺可以替代和替换源自石油化工的聚酰胺。

尸胺的生物生产可通过赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸进行生物转化或在工程化的大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的细胞工厂中发酵葡萄糖和其他糖类来实现。近年来利用赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的生物转化越来越受到重视，因为传统的L-赖氨酸生产工艺已经很成熟，赖氨酸价格很低，赖氨酸行业产能严重过剩的情况迫切需要赖氨酸的新应用。此外，由于尸胺对细胞毒性很大，直接生物转化法比发酵法更可取。据Kim等人报道，当L-赖氨酸浓度高达1.75 M时，一株高表达CadA的重组大肠杆菌能将80%的赖氨酸转化为尸胺。Wang等人构建表达了CadA和CadB（赖氨酸/尸胺转运体）的重组大肠杆菌细胞，通过基因表达和赖氨酸喂养策略的优化，最终获得了221 g/L的尸胺，赖氨酸的摩尔产率为92%。值得注意的是，利用细胞工厂将糖中的尸胺直接发酵通常效率较低。例如，Mimitsuka等人报道了利用大肠杆菌的CadA代替L-高丝氨酸脱氢酶基因（hom）的代谢工程菌C.glutamicum，以2.6 g/L的效价和9.1%的摩尔产率生产尸胺。从木糖发酵过程获得的最高水平为103 g / L，摩尔产率为32％，明显低于生物转化过程。尸胺对细胞的非特异性抑制至少部分是原因。使细胞工厂工程化以保持尸体的高浓度并经济地生产它，还有很长的路要走。L-赖氨酸的生物转化仍然是尸胺生产的工业选择。

由于尸胺是在赖氨酸的生物转化生产过程中连续释放的强碱，因此通常添加酸以保持反应条件接近酶的最佳pH。但是使用无机酸不利于经济，而使用无机盐则对环境不友好。Nishi等提出了一种有趣的替代方法，即加入有机二羧酸，该有机二羧酸可与尸胺一起共结晶并随后用于共聚过程。然而，由于通过这种方法难以除去微小的有机酸杂质，常规的无机酸中和/蒸馏方法仍然占主导地位。此外，工业用酶通常需要良好的热稳定性，以减少酶的用量并延长其有效寿命。因此，非常需要在碱性溶液中具有高活性和高热稳定性的赖氨酸脱羧酶。不幸的是，大多数现有的赖氨酸脱羧酶不能满足这些要求。例如，Lemonnier和Lane报导说，广泛使用的大肠杆菌CadA的最佳pH值为5.5，在pH 8.0时几乎失去了所有活性。LdcC的最佳pH值相对较高（7.6），但随着温度的升高而受到抑制，并在高于37°C的温度下逐渐失活。他们报告说，当LdcC在高于60°C的温度下孵育15分钟时，其活性保留不到60％，而CadA在60°C加热15分钟后非常稳定。在这项研究中，我们决定寻找在碱性pH值下具有较高活性的稳定的赖氨酸脱羧酶，以满足对尸胺绿色和经济生产的工业需求。

2.材料和方法

2.1菌株和化学品

具有化学活性的大肠杆菌DH5alpha;和大肠杆菌BL21（DE3）购自TransGen Biotech（中国北京）。用于表达的质粒pET21a（ ）获自Genewiz（中国苏州）。除非另有说明，否则所有化学药品均为分析纯或更高，可从Sigma-Aldrich或AppliChem购买。Phusion DNA聚合酶，T4 DNA连接酶和限制性酶购自New England Biolabs，所有寡核苷酸均购自Genewiz（中国苏州），无盐，冻干形式。DNA凝胶提取试剂盒和质粒提取试剂盒来自Tiangen（中国上海）。Bis-Tris蛋白凝胶和BCA蛋白测定试剂盒来自Thermo Scientific。His-trap色谱柱获自GE Healthcare Life Sciences（中国天津）。

2.2克隆赖氨酸脱羧酶编码基因

大肠杆菌K12 MG1655的基因组DNA使用TIANamp细菌DNA试剂盒（上海天根）提取和纯化。采用聚合酶链式反应（PCR）技术，结合NdeI、XhoI限制性内切酶切位点和Phusion-DNA聚合酶，扩增了CadA和LdcC基因。将扩增的DNA片段消化后插入pET-21a阳性表达载体中。化学合成了二十四个通过基因组挖掘发现的推定的LDC基因（表S1）（Genewiz，中国苏州），并在同一位点连接到pET-21a（ ）表达载体。所有26种基因产物的C端均融合了His-tag。然后将所有得到的质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）或大肠杆菌Rosetta （DE3）细胞中进行表达。

2.3赖氨酸脱羧酶的表达与纯化

将阳性转化子在添加氨苄西林（100 mu;g/ mL）的LB培养基中于37°C，220 rpm下培养。当培养物的OD600达到0.6-0.8时，添加异丙基-beta;-二硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.1 mM，并在20小时内将温度降至20℃。然后通过离心（4℃，4000g，20分钟）收获细胞，并用于酶研究或生物转化。将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液A（20 mM磷酸盐缓冲液，150 mM NaCl，1 mM二硫苏糖醇（DTT），0.1 mM PLP，10 mM咪唑，pH 7.4）中，然后通过超声处理破碎（Scientz-IID，宁波）。细胞破裂后，通过在13,000g和4°C下离心30分钟除去细胞碎片。将得到的上清液加载到用缓冲液A平衡的Ni-NTA柱（5 mL，GE Healthcare Corp）上，并以1 mL/min的流速从100至500 mM咪唑在缓冲液A中以递增的梯度洗脱保留的蛋白质。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确定收集的级分的纯度。合并含有纯酶的馏分，并使用Amicon Ultra-4离心浓缩器（10 kDa）在4℃脱盐。纯化的LDC在-80°C下以小等分试样存储在存储缓冲液（20 mM磷酸盐缓冲液，150 mM NaCl，0.1 mM PLP，5％甘油，pH 7.4）中，每等分试样在解冻后仅用于测试一次。

2.4酶活性测定

如前所述，对LDC的活性进行了一些修改。将50 micro;L含有10 mu;g/ mL LDC的缓冲液B（100 mM磷酸盐缓冲液，0.1 mm PLP，1 mm TT，150 mmNaCl）添加到50 micro;L底物溶液（缓冲液B加20 mM L-赖氨酸）中，制备每孔微量滴定板（MTP）中的反应混合物。然后将MTP在900 rpm下于37°C孵育5分钟。为了终止反应，将30 micro;L反应混合物与70 micro;L 1 M Na2CO3混合。随后，加入50 micro;L 2、4、6-三硝基苯磺酸（TNBS； 20 mM），并将样品在42℃孵育5分钟，以形成N，Nrsquo;-双三硝基苯基-尸胺（TNP-尸胺）和N，Nrsquo;-双三硝基苯赖氨酸（TNP-赖氨酸）加合物。用500 mu;L甲苯萃取TNP-尸胺，并测量340 nm的吸光度。酶活性的一个单位定义为在测定条件下每分钟释放1.0 micro;mol尸胺的酶量。通过将活性除以酶的毫克来计算LDC的比活性。用BCA蛋白质测定试剂盒（Thermo Scientific）测定蛋白质浓度。

2.5 pH对赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的影响

用缓冲液B测定pH对酶活性的影响，缓冲液B在37℃的各种pH值在5.0-8.5之间。使用标准酶测定法测量LDC的比活。通过在37℃下在各种pH值（5.0–8.5）下将纯化的酶（10 micro;g / mL）在缓冲液B中孵育7或10 h，来研究LDC的pH稳定性。通过将未孵育的酶样品的活性设定为100％来计算残留活性。所有实验均重复三次。

2.6温度对赖氨酸脱羧酶活性和稳定性的影响

确定了赖氨酸脱羧酶的最佳温度范围是37–80°C。通过在37或50°C下孵育12小时后测量纯化酶的残留活性（10 mu;g/ mL），研究了热失活行为。通过使用纳米差示扫描量热仪（DSC； TA Instruments-Waters LLC）确定熔融温度（Tm）。用100 mM磷酸钾缓冲液（0.1 mM PLP，100 mM NaCl，pH 7.4）将纯化的LDC稀释至0.2 mg / mL。在使用DSC测试之前，立即将蛋白质样品脱气，并在3个大气压下以1℃/ min的加热速率将其从40℃加热至85℃。在数据分析过程中，从蛋白质迹线中除去了基线（100 mM磷酸盐缓冲液，0.1 mM PLP，100 mM NaCl，pH 7.4作为对照）。

2.7尸胺对赖氨酸脱羧酶活动的影响

将底物溶液与可变浓度的尸胺（0、4、8、12、16、20、24和28 mM）混合。将酶溶液和底物溶液调节至各个LDC的最佳pH值（AsLdc的pH值为7.5，CadA的pH值为5.5，LdcC的pH值为7.5），然后在反应前于37°C孵育5分钟。为了计算在不同的尸胺浓度下LDC的活性，还进行了不存在酶的测量作为对照。根据2.4.测量了赖氨酸脱羧酶的活性，但TNBS溶液为40 mM。

2.8动力学分析

通过测定含有不同赖氨酸浓度（0.4-10 mM）的100 mM磷酸钾缓冲液（0.1 m PLP，100 mM NaCl）在单个最佳pH值（AsLdc、CADA和LDCC的pH值分别为7.5、5.5和7.5）下的活性，确定纯化后的赖氨酸脱羧酶（2 g/mL）的动力学参数。GraphPad Prism软件(双曲线拟合)将获得的初始速度数据拟合为方程V=Vmax[S]/([S] Km)(式中V为初始速度，Vmax为最大速度，[S]为L-赖氨酸浓度，Km为米氏常数)(其中V为初始速度，Vmax为最大速度，Km为米氏常数)。

2.9天然聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

天然赖氨酸脱羧酶的低聚状态由Native PAGE确定。总共10g纯化蛋白经过NativePAGETM Novexreg; 4-16% Bis-Tris凝胶系统(Thermo Science)，在150V下运行2h，电泳过程中的pH接近中性(pH7.5)。

2.10动态光散射

使用Brookaven Instruments的NanoBrook 90Plus动态光散射(DLS)测定LDC低聚物的存在和大小分布。纯化的酶用含0.1 mM PLP、1 mM DTT和150 mM NaCl的100 mm磷酸盐缓冲液稀释(终浓度：100 g/mL)，样品溶液通过0.22 m膜过滤器除尘。实验在37℃下进行，并对每个溶液进行五次测量。样本在数据收集前平衡20分钟。晶体结构表明，十聚体和二聚体的直径分别为18.3 nm和10.5 nm。

2.11全细胞生物转化

利用含有AsLdc或CadA的大肠杆菌全细胞，在

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