碱提玉米芯连续共培养产溶剂的新策略外文翻译资料

 2022-08-07 11:26:06

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过程生物化学49（2014）1941-1949

碱提玉米芯连续共培养产溶剂的新策略

文志强、吴绵阳、林毅军、杨丽荣、林建平、岑培林1

教育部生物质化学工程重点实验室，浙江大学化学与生物工程系，

中国杭州310027

a r t i c l e i n f o公司

文章历史：

2014年3月22日收到

2014年6月17日收到修订版

2014年7月10日接受

2014年8月1日在线提供

关键词：

ABE发酵

整合生物处理

顺序共培养

木质纤维素

糖积累优化

a b s t r a c t公司

随着对化石燃料消耗和全球环境恶化的日益关注，最近人们重新对利用丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵木质纤维素生产丁醇产生兴趣。遗憾的是，几乎没有微生物具有木质纤维素分解和溶剂生成的复合能力。与复杂的基因和代谢工程策略相比，混合培养是一种简便可行的木质纤维素强化生物工艺（CBP）发酵ABE的方法。但是很少有微生物群落能在不添加丁酸的情况下成功地生产出高效价或高产率的丁醇。本文提出了一种以低成本可再生原料碱提玉米芯（AECC）为唯一碳源，一锅法高效生产溶剂的新策略，即连续共培养热梭菌ATCC 27405和贝氏梭菌NCIMB 8052。在这一策略中，热膜梭菌水解AECC后的可溶性糖积累被认为是CBP的首要因素，与以往的共培养研究相比，这一策略大大促进了可溶性糖的积累。在糖分积累和ABE生产的组合优化培养参数下，CBP分解了88.9gL-AECC，生产了ABE 19.9gL-AECC（丙酮）1 1

3.96，丁醇10.9，乙醇5.04gL-）在200h内，不加丁酸。1

2014爱思唯尔有限公司版权所有。

1. 介绍

对汽油价格令人眩晕地上涨和全球环境恶化的担忧日益加剧，最近已将注意力集中在替代汽车燃料上，特别是丁醇和乙醇等生物燃料。丁醇是丙酮-丁醇-乙醇（ABE）发酵的主要产物，传统上由玉米、木薯、糖蜜或其他粮食作物生产[1]。同时，这些淀粉或糖基材料也是食品和饲料工业的主要原料。它们在大吨位的生物燃料工业中的应用将导致粮食和饲料的短缺和价格上涨。例如，美国玉米产量的百分比

缩写：AEC，Calkali提取去壳玉米芯；ABE，丙酮-丁醇-乙醇；CBP，强化生物处理；CCR，碳分解代谢抑制；YE，酵母提取物。

*通讯作者。电话：0571 87951220；传真：0571 87951220。

电子邮箱：linjp@zju.edu.cn（J.Lin）。

1 现住址：国家海洋局第三海洋研究所，厦门361005。

http://dx.doi.org/10.1016/j.procbio.2014.07.009 1359-5113/？2014爱思唯尔有限公司版权所有。

生物乙醇产量从2000年左右的5%上升到2011年和2012年的40%以上，与此同时，玉米价格从大约每蒲式耳2美元上升到平均每蒲式耳6-7美元[2]。为了保证生物燃料产业的可持续发展，必须开发利用非粮食原料生产生物燃料的新的经济技术。

木质纤维素生物质作为地球上最丰富的可再生资源，为ABE发酵的可持续发展提供了彻底的解决方案之一[1]。在大多数情况下，后续的ABE生产需要对木质纤维素材料进行生物或化学分解[3-7]，因为并非所有的溶解性梭菌都进化成直接利用木质纤维素作为碳源。问题是，用于水解木质纤维素的纤维素酶的成本使这些努力超出了不经济的范围[8]。

有人提出，利用廉价可再生原料生产生物燃料，是一种高效、经济的方法，因为它将纤维素酶生产、纤维素水解和发酵结合在一起，大大降低了酶生产、设备和操作的成本[9]。在CBP中，必须开发单一的生物或生物群落，才能快速利用木质纤维素，生产出高产高效的生物燃料。

尽管纤维素酶（或纤维素酶）基因已被克隆到贝氏梭菌（Clostridium beijerinckii）或乙酰丁酸梭菌（Clostridium acetobutylicum）中，以一步从纤维素中生产丁醇，但表达的异源纤维素酶（或纤维素酶）水平相当低[10–13]。将（异）丁醇生物合成途径引入纤维素分解菌的尝试也没有达到预期的效果[14,15]。纤维素分解微生物和溶解细菌的原始或人工混合培养是CBP发酵ABE的另一种方法[16-19]。与天然微生物群落相比，人工共生更容易调节，更稳定。这些人工共生体的例子包括可溶性乙酰丁酸梭菌和纤维素分解梭菌或热梭菌的共培养[17,18]。然而，除了加入丁酸诱导乙酰丁酸梭菌的溶解相外，其它微生物群落均未能产生溶剂。针对这一现象，选择了产丁醇梭菌（Clostridium sacchaccharoperbutyllacetonicum）N1-4菌株作为热细胞梭菌的合作伙伴，该菌株的产丁醇诱导机制与其他产丁醇梭菌有所不同[19]。这对细菌成功地制造了7.9gL-of1

11天内从40gL的Avicel纤维素中提取丁醇，但提供了1

ABE生产率相当低，为0.0375gL-h-。1 1

事实上，对于乙酰乙酸丁酯（C.acetobutylicum）或贝耶林奇（C.beijerincki）发酵ABE，只有在培养基中碳源浓度不够高时才会产生酸[20,21]。我们观察到，在上述所有人工系统中，糖化过程中只积累了极少量的糖，这解释了为什么乙酰丁酸C.acetobylicum或beijerinckii的ABE发酵在产酸阶段停止。因此，通过纤维素分解微生物提供足够的碳源，使溶解性微生物生长良好，并从产酸转化为溶解性微生物是当务之急。此外，粗木质纤维素中的各种成分使得使用木质纤维素的CBP比纯纤维素更复杂[22]。基于实际木质纤维素生物量的CBP研究是非常必要的。

本研究以低成本可再生原料碱提玉米芯（AECC）为唯一碳源，在一锅法反应中不加丁酸的情况下，开发出一种新的共培养策略，有效地制备溶剂。在这一策略中，热细胞梭菌ATCC27405分解AECC所积累的可溶性糖被认为是CBP的首要因素，并且与之前的共培养研究相比得到了显著的促进[17-19]。众所周知，热细胞梭菌ATCC27405是最有效的纤维素降解菌之一[23]。同时，在该共生体系中，选择了北耶林茨基C.beijerinckii NCIMB8052作为ABE发酵的生产菌株。由于C.beijerinckii具有相对宽松的碳分解代谢抑制（CCR）机制[22,24]，因此C.beijerinckii基于木质纤维素生物质的ABE生产研究最近有所加强[3–6,25]。

本研究采用AECC（一种经过简单预处理的低成本、丰富的农残）为原料，采用连续共培养的方法，进行ABE发酵。对AECC降解和ABE生产的一些重要参数进行了优化。

2. 材料和方法

2.1. 碱提取玉米芯（AECC）

玉米芯被切成大约1厘米长的碎片，然后磨成粉末，通过一系列8到100目的标准筛。用1%（w/v）NaOH在121℃蒸压6%（w/v）玉米芯20分钟，然后用1%（w/v）H2SO4中和，制备碱提取部分。用蒸馏水彻底清洗这些部分，并在80℃下干燥24小时[26]。

AECC的组成部分是使用原纤维提取器FIWE 3（Velp Scientifica /商誉（HK）技术有限公司，香港，中国）确定的[ 27 ]。AECC的纤维素、半纤维素和木质素含量分别为69.8%、27.4%和1.47%（w/w），碱提取前分别为44.9%、33.2%和14.5%。

2.2. 菌株和培养基

C、 ATCC27405热电偶是从德国Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（德国布伦瑞克DSMZ）购买的。在25%甘油中保持原种培养，并在-80℃下冷冻。

C、 beijerinckii NCIMB 8052由教授提供

杨晟，上海生物科学研究所植物生理生态研究所。在25%甘油中保持原液培养，并在-80℃冷冻。beijerinckii在TGY培养基中厌氧预培养（1L TGY培养基包含5g胰蛋白酶、3g酵母提取物、2g葡萄糖、0.25g L-半胱氨酸HCl和0.001 g resazurin；pH值6.5）。在37℃的静态条件下孵育12-16小时，即直至达到对数阶段。

C、 在接种前，以AECC为唯一碳源，在60℃的静态条件下，在200毫升培养基中厌氧预培养热细胞24小时。与文献[28]所述相比，该培养基稍加修改。一升培养基（pH7.5）含有75.0g AECC、2.1g NH4Cl、2.9g

Occl K2HPO·2H4O，·3H62gO，1.5酵母g提取物，KH2PO1.04，1.0g g lof半胱氨酸MgCl2·6HCl，H2O，0.001 0.15 gg OFOFOF

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