关节杆菌属CGMCC 3584的腺苷酸环化酶的克隆，表达和表征外文翻译资料

 2022-08-08 12:05:04

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关节杆菌属CGMCC 3584的腺苷酸环化酶的克隆，表达和表征

摘要：首次通过热不对称交错PCR从节杆菌属CGMCC 3584中克隆了编码腺苷酸环化酶的cya基因。它显示了一个开放阅读框，包含1,125 bp，编码374个氨基酸。氨基酸序列分析表明该酶是III类腺苷酸环化酶。 cya基因的表达在大肠杆菌Rosetta中进行，并通过Ni2 -NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化。 SDS-PAGE表明重组腺苷酸环化酶的分子量为45 kDa。 Vmax和Km分别确定为5.06mu;mol/ min / mg和7.56 mM。最适pH和温度分别为8.0和35°C。发现几种二价金属离子在不同程度上激活了酶，当添加50 mM Mg2 时，最大比活性达到3.04mu;mol/ min / mg。这是从节杆菌属细菌克隆腺苷酸环化酶基因的第一份报告。

关键词：腺苷酸环化酶杆菌环磷酸一磷酸腺苷，表达，表征

介绍

环腺苷3，5-单磷酸酯（cAMP）是众所周知的细胞信号转导的第二信使，并且是原核生物和真核生物中许多生物活动的重要生物活性物质（Sutherland and Rall 1957; Antoni 2000）。由于其多种生理功能，cAMP具有多种药物作用，包括放松平滑肌，扩张血管，改善肝功能和促进神经再生（Tsai等人，2004年）。由于cAMP在治疗甲状腺功能亢进，肝病以及心血管，神经，胆管和呼吸系统疾病方面的广泛临床应用，因此引起了相当大的关注（Hong和Peng，2003； Tsai等，2004）。

腺苷酸环化酶（EC 4.6.1.1）是一种在自然界普遍分布的酶（Ebstein等人1976； Confer和Eaton 1982； Rogel等人1988），它催化5-三磷酸腺苷形成cAMP（ ATP）。已经描述了六种没有序列相似性的腺苷酸环化酶，它们被认为源于趋同进化（Barzu and Danchin 1994）。其中，III类腺苷酸环化酶是产生cAMP的酶中最丰富的类型（Linder 2006），构成了原核腺苷酸环化酶的大部分（Linder 2008）。 III类腺苷酸环化酶的催化结构域起二聚体的作用，催化中心在界面处形成（Motaal等，2006）。它们采用了两种金属离子的机理，即由两个离子配位的三磷酸根组成，而其中一个激活了3-羟基，以亲核性攻击alpha;-磷酸根（Tesmer等，1999； Hurley，1999）。深入地讲，由于酶活性的不稳定和蛋白质的丰度低，纯化腺苷酸环化酶的困难阻碍了该重要酶的鉴定和广泛应用（Wang等，1981； Yang和Epstein，1983； Ishikawa）等（2000）。

即使已从嗜水气单胞菌，炭疽芽孢杆菌，支气管败血性博德特氏菌，盘基网柄菌，结核分枝杆菌，鼠疫耶尔森菌中克隆了腺苷酸环化酶（Sismeiro等，1998; Gupta等，2006; Buboltz等，2008; Linder 2006; Motaal等人，2006； Juan等，2002）和其他物种，从未从产生cAMP的菌株中克隆出cAMP合成的最后步骤中的这种关键酶。具有高cAMP产量的菌株，名为节杆菌。 CGMCC 3584以前是在我们的实验室中分离出来的（Chen等，2010）。在本研究中，通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）（Liu and Whittier 1995）从该菌株中克隆了一个编码腺苷酸环化酶的cya基因，并首次在大肠杆菌Rosetta中表达。还描述了这种重组酶的纯化和表征。

材料和方法

菌株，载体和化学物质

用作DNA供体的菌株节杆菌属 CGMCC 3584，保存在我们的实验室中。 将其保持在含有（每升）以下物质的肉汤琼脂斜面上：10 g葡萄糖，10 g蛋白胨，10 g牛肉提取物，3 g NaCl和20 g琼脂，并在30°C下培养2天。 大肠杆菌菌株DH5a和Rosetta用作宿主细胞。 使用pMD-18 T simple载体（美国Promega）和pET-28a（Novagen，中国）进行基因操作。 Takara提供了寡核苷酸，限制酶，Taq聚合酶和基因组步测试剂盒。 ATP和cAMP购自Sigma。 所有其他化学品均为分析纯，可商购。

关节杆菌CGMCC 3584全长腺苷酸环化酶基因（cya）的克隆

为了获得腺苷酸环化酶基因片段，根据两个区域（HSARKIWR和VNLAARL）的序列，设计了两个简并引物（表1），这两个区域在8个cya基因中高度保守，其中包括节杆菌氯酚A6，节杆菌 FB24，金黄节杆菌TC1，鲑鱼肾单胞菌ATCC 33209，黄褐微球菌NCTC 2665和短杆菌属BL2。使用TAIL-PCR，使用基因组步移试剂盒扩增3侧翼区域。使用的反应条件和热循环设置如Liu and Whittier（1995）所述。对应于保守区3-末端的序列，合成了嵌套的序列特异性引物。使用基因特异性引物AS941和简并引物J200，用TaKaRa LA PCR体外克隆试剂盒克隆5侧翼区域。根据DNAMAN程序组装的完整序列，设计了用于全长扩增的引物（表1）。纯化适当的PCR产物带，将其克隆到pMD-18 T简单载体中，测序，然后与已知片段序列组装在一起。

表1.本研究中使用的引物

a：对于简并引物，R =A/G，H= A / C / T，N=A / G / C / T，M =A / C，D =A / G / T

b：限制位置标有下划线

DNA序列分析和比对

使用国家生物技术信息中心（NCBI）数据库进行序列相似性搜索。用ExPASy推断序列分析，例如推定的氨基酸序列，开放阅读框（ORF），分子量和理论等电点。用软件包DNAMAN和ESPript 2.2网络站构建了来自各种原核生物的cya氨基酸序列的多重比对。

cya基因在大肠杆菌中的表达和纯化

关节杆菌的整个cya基因。使用sAC和asAC（表1）从基因组DNA扩增了没有信号肽编码序列的CGMCC 3584，并将其克隆到pET-28a（ ）的NdeI-EcoRI位点（表1，在引物下划线）。重组质粒pET-28a-cya被转化到大肠杆菌Rosetta中。所得重组大肠杆菌Rosetta菌株的收集号为CGMCC No.。 4706.当OD600达到0.8时，用0.8 mM异丙基beta;-D-1-硫代-吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导cya表达。将培养温度移至30°C，以诱导蛋白质表达再持续8 h。离心收集细胞，用100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）洗涤，在冰上超声处理，并收集上清液作为粗酶。

用预先用缓冲液平衡过的Ni 2 -NTA琼脂糖凝胶柱纯化酶制剂。用含有20 mM咪唑的100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）洗脱未结合的蛋白质后，使用相同的缓冲液以500 mM咪唑的强度洗脱纯酶。收集的纯酶用于表征实验。用SDS-PAGE和天然PAGE分别测定重组腺苷酸环化酶的分子量和寡聚状态。

酶法

根据Bellalou等人的方法进行酶测定。 （1988年）进行了一些修改。分析混合物由100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0），5 mM ATP，10 mM MgCl2和纯化的腺苷酸环化酶组成，最终体积为1 mL。将反应混合物在30℃下温育15分钟，然后通过将温度升高至95℃5分钟来终止反应。一单位腺苷酸环化酶定义为每分钟产生1mu;molcAMP所需的酶量。通过Bradford方法（Bradford 1976）测量蛋白质浓度。所有测试重复三次，并计算平均值。

反应混合物中cAMP的浓度通过高效液相色谱法，使用带有UV检测器的Agilent 1200系统和LiChrospher C18色谱柱（4.6 mmtimes;300 mm，5mu;m）进行测量。甲醇和0.05 mol / L磷酸氢二钾溶液（25：75，v / v）用作流动相，流速为0.8 mL / min。检测波长为254nm。

动力学参数的确定

在含有1–9 mM ATP的100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中测定重组腺苷酸环化酶的Km和Vmax值，并根据Lineweaver-Burk图确定。

温度和pH对腺苷酸环化酶活性的影响

通过将0.1 mL酶溶液与0.9 mL 100 pH的不同pH值（7.1–8.9）的Tris-HCl缓冲液0.9 mL孵育，确定最佳的重组腺苷酸环化酶的pH，该缓冲液含有5 mM ATP和10 mM MgCl2 ，在30°C下放置15分钟。通过将酶溶液与pH 7.1–8.9的100 mM Tris-HCl缓冲液在4°C下孵育24 h来评估酶的稳定性。测量剩余的活性，并将其与未孵育的腺苷酸环化酶的活性进行比较，将其设为100％。

在不同温度下，将0.1 mL酶溶液在0.9 mL含5 mM ATP和10 mM MgCl2的100 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.0）中孵育15分钟，以确定最佳温度。在没有底物的情况下，将酶在25–50°C下预孵育15、30、45和60分钟后，测定热稳定性。然后测定剩余的活性，将未孵育的腺苷酸环化酶的活性设为100％。

金属离子对腺苷酸环化酶活性的影响

在2 mM或20 mM各种金属离子和1 mM ATP的存在下于30°C进行了实验，考察了各种金属离子对腺苷酸环化酶活性的影响。由于Mg2 是腺苷酸环化酶活性所必需的，因此在标准条件下，添加了10mM的ATP，研究了不同浓度的Mg2 （从5mM到200mM）。

底物特异性

用5 mM的每种底物测定纯化的重组腺苷酸环化酶的底物特异性，其中包括二磷酸腺苷（ADP），单磷酸腺苷（AMP），三磷酸鸟苷（GTP），三磷酸胞苷（CTP）和三磷酸尿苷（UTP）。在标准条件下（pH 8.0、30°C，15分钟）存在10 mM MgCl2。

结果

cya基因的克隆和序列分析

一个768-bp的片段，包含节杆菌属的一部分。用简并引物扩增CGMCC 3584腺苷酸环化酶基因。通过TAIL-PCR用特异性引物和任意简并引物扩增cya片段的下游区域，同时用基因特异性引物和简并引物扩增上游片段，如“材料和方法”中所述。全长cya基因由1,125 bp的ORF组成，起始于ATG，终止于TAA，并编码一个假定的374个氨基酸残基的多肽。计算的分子量为40.6kDa，理论等电点为5.0。本文报道的cya基因的核苷酸序列已提交给GenBank数据库，登录号为JN415128。

从节杆菌CGMCC 3584的cya基因推导的氨基酸序列与NCBI数据库中可用的其他生物的序列进行了比较。它与A.chlorophenolicus A6（YP_002487408.1）的腺苷酸环化酶具有95％，81％，71％，58％和55％的一致性，

金黄色葡萄球菌TC1（YP_947196.1），鲑鱼R.salmoninarum ATCC 33209（YP_001626084.1），黄褐肉球菌NCTC 2665（YP_002956683.1），根瘤菌DC2201（YP_001855533.1）（图1）。

图1.节杆菌属A. chlorophenolicus A6（A6）的腺苷酸环化酶氨基酸序列的多重比对 CGMCC 3584（A302），金黄色葡萄球菌TC1（TC1），鲑鱼R.salmoninarum ATCC 33209（Reni），黄褐麦芽孢杆菌NCTC 2665（Micro）和根霉菌DC2201（Kocur）。 在所有序列中保守的氨基酸残基都用红色和蓝色标记。 催化结构域涉及核苷酸-核苷酸结合位点（三个位点：N1：F * DLVSYT，N2：K * VGD ** L和N3：DIY *** VN ** AR）和离子结合位点（两个位点，均“ D”）分别用箭头和星号标记

重组腺苷酸环化酶的表达和纯化lt;

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