铁-2-吡啶酮类化合物的诱导对产生菌竞争不同生态位中的作用外文翻译资料

 2023-04-02 16:16:54

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铁-2-吡啶酮类化合物的诱导对产生菌竞争不同生态位中的作用

摘 要

已鉴定出多种 2-吡啶酮生物碱具有一系列生物和药学活性，包括药物开发。然而，2-吡啶酮的生物合成调控和化学生态学在很大程度上仍然难以捉摸。在这里，在这里，我们报道了沉默的聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)(tenS)基因簇在病虫性真菌球孢白僵菌与其天然竞争对手罗伯茨绿僵菌共同培养时，诱导激活了球孢白僵菌中卵孢白僵菌素型2-吡啶酮的生物合成。发现了一种途径特异的转录因子tenR，并且tenR的过度表达很好地扩展了15-HT及其衍生物的生物合成机制。特别是，位于tenS基因簇外的一对糖基转移酶-甲基转移酶基因对被证实在其N-OH残基处介导15-HT罕见的和位点特异性的甲基葡萄糖基化。很明显，卵孢白僵菌素和15-HT都能螯合铁，这有利于球孢杆菌在共培养中战胜罗伯茨菌，适应铁充足和铁枯竭的条件。相对于野生型菌株，tenS基因的缺失对真菌的毒力没有明显的负面影响，但过表达的tenR基因可以显著增加真菌对昆虫寄主的致病力。本研究的结果很好地促进了对2-吡啶酮生物合成机理和化学生态学的认识。

重点 不同的2-吡啶酮类化合物已被鉴定，具有多种生物活性，但其化学生态尚不清楚。我们发现，当病原菌球孢白僵菌与其自然竞争对手罗伯茨绿僵菌共培养时，该真菌中沉默的tenS基因簇被激活。已证实该基因簇受途径特异性调控因子tenR的调控，该转录因子的过度表达扩大了白僵菌素 2-吡啶酮的生物合成机制。研究还发现，位于tenS簇之外的成对基因对主要化合物15-羟基卵孢白僵菌素的位置特异性甲基葡萄糖基化有贡献。卵孢白僵菌素和15-羟基卵孢白僵菌素都能螯合和隔离铁，有利于产生的真菌竞争不同的生态位。本研究较好地推进了2-吡啶酮的生物合成机理和化学生态学研究。

关键词 2-吡啶酮; 卵孢白僵菌素; 生物合成调节; 甲基糖基化; 铁络合; 生态位竞争

1.引言

次生代谢物的化学生态学已受到相当大的关注[1,2]。具有抗生素活性的生物活性代谢物与微生物相互作用有关，从而产生单边或双重抑制作用[3,4]。不同的代谢物也被证实有助于植物和昆虫病原真菌的全部毒力[5-7]。此外，不同的微生物已经进化出能够产生不同类型的细胞外和/或细胞内铁载体的能力(例如，儿茶酚、异羟甲酸盐、酚酸盐和羧酸盐)，用于铁的固存、吸收、运输、储存或解毒，这可能有助于微生物与不同环境的相互作用，包括宿主[8,9]。异羟肟酸盐型铁载体主要由不同的真菌产生[8,10]。N-羟基型2-吡啶酮含有异羟肟酸部分(图1)。除曲霉菌产生的2-吡啶酮类麻风菌素B和球孢白僵菌产生的卵孢白僵菌素外，2-吡啶酮类化合物的铁螯合活性和生物学功能仍然是难以捉摸的丝状真菌[11,12]。

从不同的生物体中鉴定出大量具有抗菌、抗肿瘤、神经营养和/或杀虫活性的2-吡啶酮类化合物，并从这些生物碱中开发出相当多的药物。丝状真菌可以产生不同结构的2-吡啶酮。例如，白僵菌和冬虫夏草等昆虫病原真菌产生类似的2-吡啶酮，如卵孢白僵菌素[14]、白僵菌黄色素[14]、粉质酮[15]、军国酮[16,17]、和玫烟菌素[18]、随着侧链的长度和甲基化程度不同(图1)。保守的聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)杂合基因簇，随着侧链的长度和甲基化程度的变化(图1)。保守的聚酮合成酶-非核糖体肽合成酶(PKS-NRPS)杂合基因簇已在不同的真菌中被证实用于合成不同的2-吡啶酮及其衍生物，如卵孢白僵菌素[19,20]，(去甲基) 白僵菌黄色素[21]，阿斯吡啶酮[22]，哈茨吡啶酮[23]，和冬青生菌素[24]。这些核心杂交酶的高还原PKS区域包含一个无功能的烯酰还原酶(ER)结构域，而PKS-NRPS的完整功能需要一个由每个簇中的单独基因编码的ER酶(图1)。例如，在球孢杆菌中[19,20]，PKS-NRPS TenS和ER TenC共同启动卵孢白僵菌素的生物合成，而曲霉ApdA和ApdC共同生物合成生产阿司匹里酮的初始中间体[22]。此外，每个簇都编码了两个不同的细胞色素P450(CYP)酶，以介导四酸盐环的扩张和中间体的羟基化为N-羟基型的2-吡啶酮(图1)。特别地，具体地说，还从球孢杆菌中鉴定出了卵孢白僵菌素的甲基葡萄糖苷型衍生物。。这种化合物的产生需要PKS-NRPS基因簇中不存在的甲基转移酶(MT)和糖基转移酶(GT)的功能(图1；另见补充材料中的表S1)。因此，2-吡啶酮的生物合成机制需要进一步阐明，包括对2-吡啶酮生产的调节。

不同真菌的SM基因簇在实验室生长条件下保持沉默是常见的，例如卵孢白僵菌素生物合成基因[26]。不同的策略，如激活全球调节因子和特定途径转录因子(Tf)和使用表观遗传修饰物，已被证明成功地诱导真菌产生代谢物[29]。否则，微生物共培养可以诱导产生新的代谢物[3,28]。这个过程可以在某种程度上模拟微生物相互作用的环境条件。不同的昆虫致病真菌，如白僵菌和绿僵菌，无所不在，并在不同的环境和微生物群中共存[29,30]。我们发现球孢杆菌不如罗氏绿僵菌竞争昆虫个体，但当两种真菌在人工培养基中共培养时，可以胜过后者[31]。这种拮抗作用的机制尚不清楚。

在此，我们报道了球孢白僵菌在共培养中通过铁的封存而产生的2-吡啶酮的产生超过了非产生的罗伯茨杆菌。结果表明，2-吡啶酮生物合成基因簇受一条途径特异的转录因子控制，代谢产物甲基糖基化与基因簇外基因的功能有关。该簇的激活也有利于产生菌耐受铁胁迫和感染昆虫宿主。

2.结果

球孢白僵菌在共培养条件下卵孢白僵菌素衍生物的产生。将球孢杆菌和罗氏杆菌在沙堡葡萄糖肉汤(SDB)中共培养后，发现

图1：不同真菌中参与类似2-吡啶酮生物合成的保守基因簇和关键的PKS-NRPS酶的构建。用相同颜色标记的基因显示了彼此的同源关系。tenA和tenB同源基因编码两个细胞色素P450酶，tenC同源基因编码可能的enoyl还原酶，tenS同源基因编码PKS-NRPS杂合酶，tenR同源基因编码一个途径特异的转录因子。指出了PKS-NRPS杂合酶的结构域。KS，b-酮合成酶；AT，酰基转移酶；DH，脱水酶；CMT，c-甲基转移酶；ER0，无功能的烯基还原酶；KR，酮还原酶；C，缩合结构域；A，腺苷化结构域；T，硫代化结构域；DKC，狄克曼环化酶。球孢杆菌生产球孢菌素的问题仍然存在。

在罗伯茨-B菌株中检测到三个峰。球孢霉1：9共培养，而罗伯茨分枝杆菌共培养出现7个峰。用高效液相色谱仪对球孢霉1：1共培养物与各纯培养物进行比较。与罗伯茨分枝杆菌和球孢杆菌的纯培养相似，在罗伯茨分枝杆菌-B中没有检测到明显的峰。球孢霉9：1共培养(图2a)。1：1共培养物的表型为色素，这与罗伯茨菌相似，而不是球孢杆菌(图2B)。然后将1：1的共培养物发酵到大容量进行复合纯化。在一维(1D)和/或二维(2D)频谱分析之后。

图2：2-吡啶酮的诱导生产。(A)显示不同样品中化合物峰产生情况的高效液相色谱图谱。将罗伯茨分枝杆菌(Mr)、球孢杆菌(Bb)及其不同比例的混合孢子接种到SDB中9天，然后提取代谢物并进行分析。(B)真菌(Co)培养的表型。将球孢白僵菌、罗氏木霉及其1：1的混合孢子接种到SDB中，共培养9天。(C)在共培养中上调tenS簇基因(球孢杆菌-M。罗伯茨按1：1的比例)。以Tub、beta;-微管蛋白基因为参照。(D)通过tenR的过度表达而不是另一个可能的转录因子(Bba_07399)的过度表达上调聚集的基因。(E)高效液相色谱分析表明，通过过表达tenR产生化合物1至7。所有培养物在SDB中培养9天，然后提取代谢物。

纯化的化合物(见补充材料中的数据集S1和S2)、化合物1至7被鉴定为与卵孢白僵菌素相关的2-吡啶酮(图S1)。其中化合物1[吡多霉素-N-O-(4-O-甲基-B- D-吡喃葡萄糖苷)(PMGP)、化合物2(吡哆维菌素)、化合物3(15-羟基卵孢白僵菌素[15-HT])和化合物7(卵孢白僵菌素)是已从球孢白僵菌中鉴定的已知代谢产物[20,25,32]。化合物4(1-O-甲基-15-羟色胺)、化合物5[(8Z)-1-O-甲基-15-羟色胺]和化合物6(称为O-甲基小球菌素A)是与卵孢白僵菌素或15-HT键结合的新型2-吡啶酮类化合物。这些化合物的产生表明，球孢杆菌和罗伯茨分枝杆菌共培养可以诱导前者产生与卵孢白僵菌素相关的2-吡啶酮类化合物。我们的逆转录(RT)-PCR分析证实，生物合成基因在共培养的球孢杆菌菌丝体中上调，但不在纯球孢杆菌培养物中上调(图2C)。

途径特异性转录因子的鉴定。与不同真菌产生的2-吡啶酮的结构相似(图1)一致，不同真菌的基因组中存在保守的PKS-NRPS基因簇，包括白僵菌、北冬虫夏草、烟色伊萨里亚和尼杜拉曲霉（表S1）。对核心PKS-NRPS结构域的系统发育分析表明，酮合成酶(KS)和酮还原酶(KR)结构域树是一致的，系统发育关系与化合物侧链长度有关(图S2)。利用获得的球孢白僵菌基因组信息[33]，接下来，我们发现两个推定的转铁蛋白基因，即BBA_07334_07339(在氨基酸水平上彼此有21%的同源性)与特征的tenS簇紧密相连[19,20]。为了测试任一种转铁蛋白对途径特异性控制的可能性，我们在球孢杆菌野生型(WT)菌株中过表达这两种基因。后续的逆转录聚合酶链式反应分析表明，BBA_07334的过表达而不是BBA_07339的过表达可以上调球孢白僵菌中的簇状基因(图2D)。高效液相色谱分析一致地在突变培养物中检测到高表达BBA_07334基因的化合物1至7，而WT和BBA_07339转基因菌株不产生代谢物(图2E)。因此，我们鉴定了途径特异的转铁蛋白基因BBA_07334，命名为TenR。这种类似tenR的基因也保守地存在于其他真菌中（图1、表S1）。为了进一步验证它的功能，我们在一个WT菌株中过表达了tenR，它是球孢杆菌的近亲，也包含保守的PKS-NRPS(farS)基因簇（表S1）。结果发现，该簇基因可以被激活，并且在色素突变培养中产生了一个尖锐的峰(图S3A至C)。经鉴定，该化合物为2-吡啶酮粉糖酮B(图S3D和数据集S1和S2)。

接下来，我们在tenR过度表达(OE∷tenR)菌株中进行了核心PKS-NRPS基因tenS和两个CYP基因tenA和tenB的缺失。在不同的实验中，也在WT株中进行了tenS的缺失。真菌在SDB中生长9天后，高效液相色谱分析表明，OE∷tenR △tenA菌株产生了8到13个峰，而OE∷tenR △tenB菌株产生了一个单峰。与作为纯培养物生长的WT菌株类似，从OE∷tenR △tenS样品中没有检测到峰(图3A)。OE∷tenR △tenB菌株产生的单一化合物经鉴定为已知化合物2吡哆韦菌素(32)。其中8号峰(12-氢化卵孢白僵菌素A)、10号峰(14-氢化卵孢白僵菌素 A)和13号峰(Prototenellin D)为已知化合物(26个)，代谢物9(13-Heptenellin A)、11(9-Heptenellin A)和12(12-oxopretenellin A)为新化合物。(图S1和数据集S1和S2)。

基因簇外4-O-甲基糖基化基因的鉴定。在发现化合物1,PMGP是15-HT的4-O-甲基糖苷后，我们对参与15-HT甲基糖基化的基因很感兴趣。进一步检查tenS簇没有发现任何近端的GT和MT基因。。然后，我们对球孢杆菌-罗伯茨酵母1：1共培养的纯培养物进行了转录组测序(RNA-se

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