基于金属有机框架的固定化纤维素酶系统的开发以提高离子液体的耐受性和蔗渣原位糖化能力外文翻译资料

 2023-05-16 15:27:04

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基于金属有机框架的固定化纤维素酶系统的开发以提高离子液体的耐受性和蔗渣原位糖化能力

作者：Min Zhou, Xin Ju, Zheng Zhou, Lishi Yan, Jiajia Chen, Xuemei Yao, Xinqi Xu, Liang-Zhi Li

摘 要

为了实现对离子液体（IL）的高耐受性并促进生物质的原位酶水解，四种金属minus; 有机骨架（MOF）载体，包括ZIF-8、UIO-66 NH2、MIL-100-Fe和PCN-250，通过简单的物理吸附用于纤维素酶固定化。结果表明，ZIF-8在176.16mg/g载体上具有最大的酶吸附量。此外，以羧甲基纤维素（CMC）和滤纸（FP）为底物，在1-乙基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯（[Emim]DEP）存在下评估固定化纤维素酶的活性。当白介素浓度从0%增加到50%（v/v）时，固定化纤维素酶与游离纤维素酶相比表现出更好的白介素耐受性。特别是，ZIF-8固定化纤维素酶表现出显著的IL耐受性，其中50%（v/v）[Emim]DEP中的羧甲基纤维素酶（CMCase）和滤纸纤维素酶（FPase）的活性分别增加了112.59%和59.86%。动力学参数分析进一步表明，在含有IL的反应系统中，固定化纤维素酶具有较低的平衡离解常数（kd）值和较高的最终酶平台活性（ap）值，这表明固定化酶可有效降低IL引起的纤维素酶失活。最终，在50%（v/v）[Emim]DEP中，ZIF-8固定化蔗渣原位水解纤维素酶比游离纤维素酶增加92.92%。

关键词 纤维素酶；固定化；离子液体；失活动力学；木质纤维素；金属minus;有机框架

简介

木质纤维素是一种在自然界中广泛存在的可再生农林资源，是植物细胞壁的主要组成部分。木质纤维素原位糖化生成可溶性糖是实现生物资源有效利用的最重要途径之一。由于分子间和分子内氢键以及范德瓦尔斯相互作用的广泛网络，木质纤维素不溶于水和常见的有机溶剂，表明有必要进行预处理以降低结晶度和增加溶解度。木质纤维素的传统预处理方法主要包括蒸汽爆破、稀酸、氨纤维膨胀、热水以及石灰和有机溶剂预处理技术。一般来说，离子液体（ILs）预处理具有绿色环保、优良的溶解性、低熔点、，非挥发性和可设计性。然而，IL可引起不同程度的纤维素酶灭活。为了避免负面影响，彻底清除ILs必须进行大量清洁。然而，从酶系统中去除IL是一个复杂且昂贵的过程。为了更多地利用原位糖化的优势并实现一锅化反应，许多学者致力于改善纤维素酶与ILs之间的兼容性。将纤维素酶固定在载体上有助于提高ILs中纤维素酶的稳定性和活性。先前关于IL中纤维素酶载体的研究主要集中在壳聚糖、二氧化硅、磁性载体，复合载体，和一种新开发的载体及其改进。迄今为止，对ILs中固定化纤维素酶活性的研究数量有限，而现有研究表明，ILs中固定化纤维素酶的研究具有令人满意的发展潜力。

例如，壳聚糖固定化纤维素酶在20%（v/v）1-甲基-3-甲基咪唑磷酸二乙酯（[Mmim]DEP）中的水解率是游离纤维素酶的2.3倍。磁性二氧化硅纳米颗粒固定化纤维素酶在50%（v/v）1-乙基-3-甲基咪唑乙酸乙酯（[Emim]OAc）中的剩余内切葡聚糖酶活性是游离纤维素酶的2倍，聚乙二醇化氧化石墨烯固定化纤维素酶在25%（v/v）1-丁基-3-甲基氯化锂（[Bmim]Cl）中的相对酶活性是游离纤维素酶的30.5倍，16固定化纤维素酶的单甲氧基聚乙二醇醛（PEG-ALD）的相对酶活性比在15%（v/v）中的游离纤维素酶提高17.11%1-（2羟乙基）-3-甲基咪唑醋酸酯（[C2OHmim]OAc）。然而，固定化纤维素酶的研究仍然存在一个问题；尽管酶的负载量并不显著，但交联剂对酶的抑制作用，以及纤维素酶在载体上的固定方式和固定化酶在IL中的失活动力学，仍然难以捉摸。

金属-有机骨架(mofs)是由金属离子或团簇与有机配体配位形成的三维孔结构化合物，是继沸石和碳纳米管之后又一种重要的新型多孔材料，由于其稳定的性质和结构，目前已用于固定各种生物大分子，如胰蛋白酶、22种脂肪酶、23种理化脂肪酶和漆酶等。另外，高比表面积使纤维素酶具有显著的吸附潜力。近年来，虽然有报道称纤维素酶通过物理吸附固定在 uio-66-NH2mof 上，但纤维素酶被多孔材料吸附的固定化行为，如孔隙吸附、表面吸附或官能团共价键等，仍有待进一步研究。尤其是生物质原位酶法糖化的实际应用，受到了酶液对纤维素酶失活的限制。因此，建立一个稳定的固定化纤维素酶系统来提高细胞的耐受性是十分必要的。

在本研究中，四种MOF材料，包括ZIF-8、UIO-66-NH2、MIL-100-Fe和PCN-250，由于其物理化学稳定性和水稳定性，被选为MOF载体。通过上述MOF材料详细研究了酶负载量。通过X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）和氮气吸附等温线分别对固定化纤维素酶的结构、形貌、SSA和孔特征进行了表征。此外，本研究首次解释了MOF材料吸附纤维素酶的可能方式。具体而言，深入探讨了ILs中固定化纤维素酶的活性以及ILs反应体系中甘蔗渣（BG）的原位糖化。同时，对固定化纤维素酶在离子液体中的失活动力学进行了详细的研究。据我们所知，本研究首次探索将纤维素酶固定在MOF载体上以提高其IL耐受性。

材料与方法

材料

[Emim]OAc、[Emim]DEP、1-乙基-3-甲基氯化锂（[Emim]Cl）、1-乙基-3-甲基溴化锂（[Emim]Br）、1-丁基-3-甲基氯化锂（[Bmim]OAc）、[Bmim]Cl、2-乙基甲胺醋酸盐（EMA]OAc）、乙酰胆碱醋酸盐（[Ch]OAc）和三乙胺醋酸盐（[TEA]OAc）纯度为99%购自中国上海晨洁化工有限公司。四种MOF材料，包括ZIF-8、UIO-66-NH2、MIL100 Fe和PCN-250，从上海化顺有限公司（中国上海）购买。Whatman 1号FP购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。BG来自中国江苏省。所有其他试剂（分析级）和绿色木霉商用纤维素酶均从国药集团化学试剂有限公司购买。

MOF的活化和纤维素酶在MOF上的固定化

MOF活化的主要目的是去除主链上残留的溶剂分子和反应物分子。活化MOF是一种合适的功能材料，具有相对较高的比表面积和令人满意的吸附性能。在本研究中，溶剂置换法用于用低沸点溶剂溶解孔隙杂质；去除溶剂后，通过真空干燥获得活化MOF材料。具体步骤如下：向离心管中添加100 mg如上所述的MOF材料和8 mL无水甲醇，然后超声处理30分钟，并将离心管置于振动筛上24小时。离心后去除上清液甲醇，重复上述实验三次。然后，将离心管置于真空干燥箱中12 h，在其中获得活化MOF材料。采用纯物理吸附法将纤维素酶直接吸附在活性MOF材料上。同样，将100mg载体与5mg/mL纤维素酶溶液（0.1M柠檬酸盐溶液，pH值5.0）混合。然后，在培养箱中以150 rpm的转速在30°C下摇晃60 min进行纤维素酶沉淀。用柠檬酸盐缓冲液（0.1 M，pH 5.0）洗涤固定化酶三次，以去除非固定化纤维素酶。最终，在真空干燥后将固定化纤维素酶储存在4°C下以供进一步使用。28此外，如前所述，测定MOF材料吸附的蛋白质量。

固定化纤维素酶的特性

MOF材料和固定化纤维素酶的晶体结构和官能团分析通过XRD（德国卡尔斯鲁厄D8 DISCOVER）和Cu-Ka辐射（k=0.15418 nm，在40 kV和40 mA下产生）进行确认。样品以5°至40°的散射角进行扫描。非磁性MOF材料的表面形态通过SEM（FEI Quanta，Hillsboro，OR，USA）进行表征，固定化纤维素酶的表面形态通过SEM（蔡司Sigma 500，德国）进行表征。非磁性MOF样品在观察前涂上一层薄薄的金以提高导电性。所有图像均在100000times;times;的放大倍数下拍摄。氮气吸附等温线是在ASAP 2020（美国佐治亚州诺克罗斯市Micromeritics）中用微粒子公司测量的。巴雷特酒店minus;埃米特minus; 采用Teller（BET）法计算了预处理后IL中纤维素的SSA和孔径特性。

IL中纤维素的预处理

根据我们以前的报告。将一定浓度的IL在试管中预热，并在磁力搅拌下将纤维素在磁力搅拌下，将纤维素样品（FP或BG）加入试管小瓶中。搅拌30分钟后，将柠檬酸缓冲液（pH5，0.1M）加入预处理过的纤维素样品中。搅拌30分钟后，向预处理后的纤维素溶液中加入柠檬酸缓冲液（pH5，0.1M)并迅速形成沉淀。迅速形成沉淀。在使用前，用柠檬酸缓冲液将pH值重新调整到5.0，以减少pH值的变化。以减少IL引起的pH值变化。当在磁力搅拌下，预处理过的纤维素被均匀地混合在一起。等量的预处理过的纤维素悬浮液被移入管中，以便使用。

固定化纤维素酶的活性和IL中BG的原位糖化

纤维素酶的活性是根据国际标准程序显示的。国际标准程序。羧基甲基纤维素酶（CMCase)纤维素酶（CMC酶）的活性是通过将纤维素酶与CMC底物孵育30分钟来评估的。与CMC底物在0.1M柠檬酸盐缓冲液中于40℃孵育30分钟(pH 5.0)。FP酶的活性是通过将0.5毫升的纤维素酶与50毫克的Whatdollie混合来测量的。纤维素酶与50mg Whatman No.在0.1M柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）中于40℃孵育1小时。BG的原位糖化除了用BG作为底物外，BG的原位糖化是在相同的条件下进行的，以分析FP酶的活性。孵化后，释放的还原糖数量由用3,5-二硝基水杨酸（DNS）方法测定。为了研究ILs对固定化纤维素酶的影响，不同的为了研究IL对固定化纤维素酶的影响，在纤维素酶活性测定试剂盒中分别加入不同浓度（0%-50%，v/v）的IL。分别加入纤维素酶活性测定试剂盒。在原位糖化时，用0.5％的酒精将pH值调至5.0。用0.1M柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）调节到5.0。没有ILs的反应作为对照。

固定化纤维素酶在IL中的失活动力学

为了比较固定化纤维素酶和自由纤维素酶在IL中的失活动力学。为了比较固定化纤维素酶和游离纤维素酶在IL中的失活动力学，将不同浓度（10%, 30%, 50%; v/v）的ILs分别加入到纤维素酶活性测定试剂盒中。残留的在不同的IL浓度下，纤维素酶的剩余活性（RA）是以相同的时间间隔测量的。在同一时间段内测量。纤维素酶的RA是在40℃下，在0.5℃下测定30在0.1M柠檬酸盐缓冲液（pH5.0）中，以CMC为底物，在40℃下测定纤维素酶的RA。底物。纤维素酶的活性是通过DNS在最佳反应条件下确定纤维素酶的活性。在目前的研究中，在时间和IL浓度的基础上建立了一个模型。在目前的研究中，根据时间和IL浓度建立了一个模型，以量化假设的纤维素酶失活在目前的研究中，在时间和IL浓度的基础上建立了一个模型来量化纤维素酶的假定失活行为（公式1）。在这里，酶的浓度被描述为残留的酶活性来描述。剩余活性（a）取决于最初的酶活性（a0），最终的酶高原活性（ap），以及平衡解离常数（kd）。

a=(a0-ap)e-kd·t ap (1)

引入的ap和kd参数被进一步用于本研究的稳定性分析。本研究中进行的稳定性分析。ap被假定为与浓度依赖的平衡相关。

结果与分析

固定在MOF上的纤维素酶

在MOF材料被激活后激活后，将100毫克MOF载体与10毫克/mL的纤维素酶溶液（0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH5.0）在一个10mL系统中。在本研究中，纤维素酶被固定在两种非磁性的MOF材料（ZIF-8和UIO-66-NH2）和两种磁性材料（MIL-100-Fe和PCN-250）。蛋白质吸附的方式蛋白质被吸附在MOF载体上的方式可能有三种不同的可能性，如表面吸附、孔隙吸附、或官能团的共价键。(图1(A))。如图1（B）所示，最大的蛋白质的吸附能力出现在ZIF-8的情况下，为176.16 mg/g。蛋白质吸附量为176.16 mg/g，其中ZIF-8的蛋白质吸附量为1.5 mg/g。UIO-66-NH2、MIL-100-Fe和PCN-250的蛋白质吸附量为146.8、136.45。和119.88 mg/g，均低于ZIF-8。这比Z

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