微生物碱性蛋白酶的优化生产参数及其性能外文翻译资料

 2022-07-26 14:30:06

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微生物碱性蛋白酶的优化生产参数及其性能

Kanupriya Miglani Sharma, Rajesh Kumar, Surbhi Panwar,Ashwani Kumar

摘要 蛋白酶是能够将蛋白质降解为小肽的水解酶氨基酸。它们占工业酶的近60%。蛋白酶广泛应用于商业、食品、医药、皮革和洗涤剂工业。考虑到它们的潜在用途,我们对发现具有新颖性质的蛋白酶和不断的推力来优化酶的生产有了新的兴趣。这篇综述总结了大量关于碱性蛋白酶各方面的大量报告，报道了碱性蛋白酶产生菌的分离来源。各种营养和营养介绍了影响固态发酵碱性蛋白酶生产的环境参数。对几种微生物碱性蛋白酶的酶学性质和理化性质进行了探讨,有助于识别的鉴定极端ph和温度的活性和稳定性,使它们能够为工业生产服务。

1 .介绍

酶在古代发酵过程中的使用是从古代就知道的。它们的存在与古希腊的历史有关,在那里,微生物酶用于烘焙、酿造、酒精生产、奶酪制造等,并具有更好的知识和分析技术,证明可以发挥多种功能,例如蛋白质的选择性改性和蚕丝蛋白溶解等[ 9]。根据2014年公布的世界酵母市场研究报告,全球酵素市场预计将记录复合年增长率(CAGR)预计期间约为7.8%，2015年至2020年,价值达到6.3亿美元[54]。这是由于制药业酶、精细化学品生产、生物酒精生产和洗涤剂行业持续强劲增长[ 35]。蛋白酶是重要的工业酵母,占全球酵素销售额的60% ,代表着三大工业酵素之一[ 88 ]。

蛋白酶是自然界普遍存在的酶,催化水解反应导致蛋白质分子分解成多肽和氨基酸[ 126]。与植物和动物相比,微生物是一种很有吸引力的蛋白酶来源,因为它们可以在相对短的时间内通过既定的发酵方法在大量的条件下培养,并且产生大量的、定期的产品供应。此外,微生物蛋白具有较长的货架期,可以在不超过理想条件下储存几周,而不会失去活性。一般微生物蛋白酶在自然界中是细胞外的,直接将其分泌到发酵液中,从而简化酶的下游加工,与从植物和动物获得的蛋白酶相比[ 70]。

在早期,蛋白酶是经典的

来源(动物、植物或微生物)、催化作用( endo或exopeptidases )、分子大小、电荷或底物专一性,然而,酶委员会( EC)推荐一个更合理的系统,它为所有酶的提供六个主要的类。根据酶委员会( EC )经典阳离子,蛋白酶属于三类(水解酶) ,和下标(水解肽) [ 126]。酶委员会确认了四种机械类型,到目前为止,六种蛋白酶被公认:丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21)、丝氨酸羧基蛋白酶(EC 3.4.16)、半胱氨酸蛋白酶(EC 3.4.22))、天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)和梅塔洛蛋白酶I (EC 3.4.17) 与梅塔洛蛋白酶[ 137]。碱性蛋白酶( EC.3.4.21-24, 99 )被定义为那些蛋白酶,它们是活跃在中性到碱性ph范围内的蛋白酶。它们要么有丝氨酸中心,要么是梅塔洛,它们是主要研究的集团,因为它们广泛用于洗涤剂、食品、医药和皮革工业。[ 47]。蛋白酶的性能受工业过程的pH、离子强度、温度和机械处理等因素的影响。新型酶具有能进一步提高工业生产的新特性,一直是工业生产的需要。

由于他们对工业的巨大需求,研究人员不断探索蛋白酶的不同方面[ 64,57,34,61]。因此,考虑到这一点,本文将重点介绍碱性蛋白酶产生菌的分离以及微生物碱性蛋白酶的产生和特性。讨论了蛋白酶资源开发和酶法改性以获得更强的蛋白酶的策略。

2 .产碱性蛋白酶微生物的分离

碱性蛋白酶是自然界中普遍存在的不可或缺。它们通过在碱性介质上的表面电镀和随后的筛选来从各种来源隔离。表1显示了从不同来源分离的一些产蛋白酶微生物。自然生境,例如在兰高，曼尼普尔邦,印度的垃圾堆积场[ 66 ] ;埃及碱湖[ 53 ] ;特拉的lonar 碱湖,[81];约旦的温泉[ 10]已被探索分离的蛋白酶产生微生物。皮革工厂的土壤样品[ 100,20 ] ,洗涤剂工业[ 86 ],木材工厂[ 106 ]牛奶加工厂[ 23 ]和制革废料等工业废料[ 37,11,123 ] ,也使用了食品加工工业废水[ 104]。蛋白酶生产商从古鲁格舍德拉大学校园采集的土壤样品中分离到了甘蔗糖蜜[ 141 ]、泰国鱼露[ 140 ]、苏啊闹[ 26 ]得蔬菜废弃物[ 55 ]、动物粪便[ 110,12,108 ]、退化和新鲜肉类[ 46 ]和水牛皮[ 143]。用于分离碱性蛋白酶的其他来源包括红树林沉积物样品[ 133 ] ,含有死动物残留物的堆肥[ 85 ] ,蚯蚓堆肥土壤样品[ 144 ] ,污水污泥样品[ 22 ] ,肉类废物污染土壤[ 60 ]和来自家禽废物现场的土壤[ 39]。从食用菌侧耳属的子实体中分离到碱性蛋白酶。同样,麻盖菌的蛋白酶的生产已经有结果[ 145]。从制革和周围土壤、农业土壤、农田、水源的污水中分离到39种蛋白酶、来自加仑湖钓鱼场中的中性和碱性磷的沉积物[ 102]。

表1碱性蛋白酶产生微生物的不同来源

3 .深层发酵碱性蛋白酶的研究

发酵的性质,影响微生物生长的各个方面以及酶的生产[ 49]。使用液体培养是有利的,因为易于消毒和过程控制在这些系统中更容易工程师[ 134]。通常使用液体发酵产生蛋白酶其在一致产酶特征方面的明显优势,因为成分明确培养基、工艺条件和下游优势,尽管中组分的成分集中 [ 97]。

3.1 .中小企业发酵条件的优化

媒介成分在酶中的作用微生物生产。除了温度、p h等环境因素外,培养时间对微生物代谢也有很大的影响[ 1]。这些因素对于促进、刺激、增强和优化蛋白酶[ 99]的生产至关重要。为了获得高产和商业上可行的蛋白酶,必须优化发酵培养基,以促进蛋白酶[ 109]的生长和生产。建立了不同微生物来源的碱性蛋白酶的最佳生产工艺。每种微生物或菌株都有其独特的产酶条件。

3.1.1 .增长媒体来源

碳和氮是重要的媒介成分,它作为微生物生长和产酶的重要刺激物。以1%(w/v)的葡萄糖为碳源在生长介质中,观察到细菌菌株部最大产酶。使用葡萄糖时,蛋白酶生产为59.10 U/ml[109]。在添加葡萄糖的条件下,增加了专性嗜碱芽孢杆菌AL-89 对蛋白酶产生的水平。AL-20蛋白酶在葡萄糖的存在下生产被抑制。在后一种情况下,葡萄糖可以作为分解代谢的抑制剂[ 41]。米曲霉637菌株产酶随着葡萄糖浓度的增加,增加到0.6% (w/v) ,进一步提高到1.2% (w/v) [ 124]。在添加 60 g/l葡萄糖的培养基中,得到碱性蛋白酶( 2450 U/ml )的最大产量,并进一步增加葡萄糖浓度,使产酶略有下降[ 35]。高浓度葡萄糖抑制链霉菌生产的酶，0.5% (w/v)为最适产酶,最适生长为1% (w/v)浓度[ 76]。这可能是由于分解代谢的的抑制机制提示在缺乏葡萄糖的情况下;该蛋白酶除了作为氮源外,还在提供肽类或氨基酸作为碳源或能源方面发挥作用。因此,当细胞的能量状态较高时,在葡萄糖的存在下可以抑制蛋白酶合成。( Ccp A )负责糖分解代谢的调节机制,并作为蛋白酶合成抑制的信号[ 128]。嗜热脂肪芽孢杆菌活性被葡萄糖抑制,但在添加蔗糖的基础培养基增强[ 22]。铜绿假单胞菌生产蛋白酶的研究中，添加葡萄糖和果糖的条件下,大豆多芯片模块中的MCM B-327抑制率分别为95%和60% .另一方面,果糖和葡萄糖被证明是提高黄曲霉和土曲霉菌蛋白酶生产率的最佳碳源[ 20]。Kumar等人。[ 70 ]利用葡萄糖、乳糖、半乳糖和淀粉等多种碳源用于枯草杆菌蛋白酶生产,并报告了乳糖( 10 g/l )的最大蛋白酶生产( 622.64 U/ml)介质中的碳源。同样Dodia等人[ 33]在对8个产蛋白酶菌株的研究中发现,大多数菌株的产酶最适合于乳糖。地衣芽孢杆菌BBRC 100053在以乳糖为碳源的培养基中表现出较高的蛋白酶活力[ 42]。5%(维丁格尔)淀粉为碳源,导致芽孢杆菌产生最大蛋白酶。2 [ 28]。在各种淀粉基碳源中, 58菌株生长良好.玉米淀粉浓度为0.5%(w/v)时,蛋白酶的产率最高,其次是小麦面粉和麦麸。但是,马铃薯淀粉的添加引起蛋白酶滴定度下降可能是由于土豆蛋白酶抑制剂的存在[ 67]。当使用淀粉作为碳时，获得了玫瑰花芝麻素的最高蛋白酶产量来源，而葡萄糖[135]最小，而Jaswal等 [55]报道，麦芽糖和葡萄糖与淀粉和果糖相当，显着好转环状芽孢杆菌生产蛋白酶。发现5％（w / v）的蔗糖对放线菌诺卡氏菌 HA4的酶生产是最佳的[88]。葡萄糖和蔗糖被发现是L. mylittae的生物量和蛋白酶生产的最好的两个来源，特别是当这两个来源在培养基中以1:1的比例组合在一起[145]。 据报道，葡萄糖也是合适的碳源蛋白酶产生枯草芽孢杆菌菌株[29]。在碳中发现荧光假单胞菌，麦麸和麦芽糖用于蛋白酶生产的来源支持蛋白酶生产[60]。 观察到小麦粉最多对芽孢杆菌属的蛋白酶生产有效 [23]。 Usharani和Muthuraj [131]报道芽孢杆菌属能够利用广泛的碳源; 最好的用于蛋白酶分泌的碳源是可溶性淀粉，柠檬酸三钠，柠檬酸和甘油。

对特定氮补充剂的要求不同于有机体和有机体，不同的工作人员使用不同的有机氮源（简单或复杂），无机氮源和氨基酸来增强蛋白酶生产。研究了不同氮源（如浓度为1％的蛋白胨，胰蛋白胨，硝酸钾和酵母提取物磷酸盐）对使用莱茵海默病菌株（KM459533）生产蛋白酶的影响，酶产量为433.63 U / ml [128]。 （NH4）2HPO4也被认为是最好的氮源用于A.oryzae 637 [124]的蛋白酶生产。据报道，硫酸铵是芽孢杆菌属蛋白酶生产的最佳氮源。菌株AS-S20-I [82]。据报道，氯化铵和硫酸铵抑制了芽孢杆菌属的碱性蛋白酶生成。 2-5 [28]。氯化铵和尿素都不利于L. mylittae的生物量或蛋白酶生产;然而玉米浆增加了蛋白酶的产生[145]。对L. mylittae的生物量或蛋白酶生产是有益的;然而玉米酒增加了生产蛋白酶[145]。

在生长培养基中牛肉提取物作为氮源的存在下，观察到蜡状芽孢杆菌菌株146的最高水平的蛋白酶生产。酵母提取物，蛋白胨和胰蛋白胨的存在增加了生长，但在这种情况下导致了低蛋白酶生产[106]。另一种芽孢杆菌属蛋白酶生产的最佳氮源 是牛肉提取物，而酵母提取物和胰蛋白胨也相当[86]。此外，当牛肉提取物用作氮源时，获得了链霉菌（Streptomyces roseiscleroticus）[135]，黄曲霉（A. flavus）和土曲霉（A. terreus）[20]的蛋白酶最高。发现胰蛋白胨可以增加芽孢杆菌菌株的蛋白酶生产[123]。用荧光假单胞菌蛋白酶生产的氮源（牛肉提取物，胰蛋白胨，蛋白胨，甘氨酸，酪蛋白）中，蛋白胨最大滴度报告[60]。蛋白胨也被发现是最适宜的，由N. prasina HA4 [88]和地衣芽孢杆菌BBRC 100053 [42]的蛋白酶生产。最佳提取物对芽孢杆菌属的酶促生产的增强具有最大的影响[97]。链霉菌属 酵母提取物的生长和酶生产最佳[76]。一些工作人员[95,1,113,42]报道了蛋白胨和酵母提取物的组合对于蛋白酶生产是最佳的。在芽孢杆菌APP1的情况下 ，在所有使用的有机氮源中，豆粕对细胞外蛋白酶的产生具有显着的影响[23]。Jaswal等 [55]也报道，大豆粉比酪蛋白，明胶和蛋白胨更好地用于环状链球菌生产蛋白酶。 通过大豆粉和胰蛋白胨组合获得铜绿假单胞菌MCM B-327的最大蛋白酶产生[144]。Sharma等人 （2005）报道了酪蛋白，蛋白胨，酵母提取物和牛肉提取物作为细菌菌株AKS-4的蛋白酶生产的氮源，并在酪蛋白存在下观察到高蛋白酶生产（49.77U / ml）。对于微生物菌kr10的蛋白酶生产，羽毛粉被观察为最佳氮源[129]。 在不同的有机氮源中，脱脂乳在枯草芽孢杆菌后得到最大的蛋白酶产量，然后是麦芽提取物，蛋白胨和酵母提取物。 发现氯化铵作为无机氮源抑制生产。 MgCl2和CaCl2诱导的蛋白酶生产已经报道芥子蛋糕是链霉菌（Streptomyces ambofaciens）蛋白酶生产的理想氮源[15]。

3.1.2.环境条件

3.1.2.1. 孵化期

孵化期显着影响酶的产生，并且根据微生物的类型和其他培养条件如接种物大小，细胞pH和温度的代谢状态，从24小时到一周变化。孵化后16小时，短小芽孢杆菌UN-31-C-42的蛋白酶生产逐渐增加，约28h达到最大值[52]。对于枯草芽孢杆菌PE-11 [3]和地衣芽孢杆菌LBBL-11 [90]，在2天后观察到最大生长和酶产生。芽孢杆菌菌株APP1 [23]在孵育2天后产生最大的蛋白酶滴度，但在4天的潜伏期后记录到最高的生物量产量。 枯草芽孢杆菌KO菌株在48小时的潜伏期内表现出蛋白酶的最大产量[141]。荧光假单胞菌在培养24小时后产生最大蛋白酶，酶活性从48小时逐渐降至168小时[60]。在72小时后记录了V. pantothenticus [46]，枯草芽孢杆菌[69]和地衣芽孢杆菌[69]的最大蛋白酶生产。已报道了地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌蛋白酶生产的最佳孵育时间为96 h [14]。枯草芽孢杆菌ATCC 633和芽孢杆菌属 据报道，UFLA 817 CF在24小时生长后显示出最大的蛋白酶活性，这是与指数期结束相一致的时期[31]。蜡状芽孢杆菌VITSN04的蛋白酶分泌遵循与生长类似的模式，指数期酶活性最高[127]。G. caldoproteolyticus sp.nov的蛋白酶生产。 [22]，克氏杆菌58号[67]，短芽孢杆菌SSA1 [4]，坚果芽孢杆菌MTCC 7728 [100]，杀线虫（Sororhabdus nematophila BA2）和地球微生物菌 据报道EMB2 [63]分别在孵化9,48,72,48,48和72 h后达到稳定期的最高水平。随着时间推移，产黄青霉的酶产量逐渐增加，培养72 h后获得最高的酶活性，延

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