来自不同寄主植物的埃及灰葡萄孢菌株的表征外文翻译资料

 2022-08-08 20:37:30

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来自不同寄主植物的埃及灰葡萄孢菌株的表征

摘要

灰霉病给果蔬生产造成了巨大的经济损失。目前对灰葡萄孢菌的埃及种群结构的研究表明，该物种由四种TE基因型组成：转座子，真空，体型和鳍状肢，使用可转座因子，并且对羟苯胺类杀菌剂，苯六胺敏感。结果表明，转座子是灰质芽孢杆菌采样种群中的主要分离株类型（63.6％）。但是，这四种分离物类型均对苯六甲酰胺敏感，无论其位置，寄主植物和植物器官如何。另外，使用对生菜的人工感染测试，从不同寄主植物中收集的灰葡萄芽孢杆菌分离物没有表现出任何寄主偏好。此外，在分离株类型与侵略性之间未发现任何关系，并且在从不同地点和寄主植物收集的分离株之间未发生发散事件。结果表明，在当前采样的农作物中尚未发生灰葡萄双歧杆菌的宿主专业化。

关键词

耐六甲酰胺，灰霉病，分子表征，致病性变异，转座因子

  1. 简介

灰葡萄孢（远对称性：葡萄孢白僵菌）是一种坏死性真菌，可导致数百种双子叶植物上的灰霉病，并且是在温带和亚热带地区受到影响的多种农作物的臭名昭著的病原体，导致所有植物的软腐烂空中植物部分，以及全世界收获后蔬菜，水果和花朵的腐烂。 灰葡萄孢菌已成为坏死性真菌分子研究的重要模型，并且还能够作为内生菌在植物内部定植，而不会引起任何疾病或胁迫症状。 通常，真菌基因组变异性来源之一是转座因子（TEs）的存在。

先前对法国，智利灰褐芽孢杆菌种群的研究表明，该物种由两个同胞种组成，即转座和真空，而在美国灰褐芽胞杆菌中发现了三种TE基因型。 Transposa有两种类型的可转座元素：boty和鳍状肢，而真空中则不存在这两种元素。此外，表明转座分离物与真空分离物在致病性上没有差异。最近，对不同核基因的分子研究表明，灰葡萄双歧杆菌种群被分为两个不同的进化枝：系统发育物种I和II。所述的第一组分离物仅来自真空转座子类型，而第二组可具有转座子，鳍状肢（仅包含鳍状肢），鲍蒂（仅含鲍蒂）或真空基因型。先前的研究表明，某些真空分离株对羟基苯胺杀菌剂苯六胺具有抗性，而其他研究表明真空分离株具有敏感性。此外，据认为灰质芽孢杆菌由于其攻击多种宿主植物而没有宿主特异性。 Giraud等。 （1999年）报道，从不同寄主植物中收集的灰葡萄双歧杆菌种群中，转座和真空的发生率显着不同。根据最近的这些研究，看来灰葡萄双歧杆菌可能具有宿主特化，这与传统观点相反。目前，尚不清楚埃及的灰葡萄孢种群中是否存在这两种同属菌种，以及它们是否对较新的杀真菌剂苯六胺具有抗药性。本研究的目的是确定：1​​）埃及存在灰葡萄孢的物种类型； 2）从不同寄主植物中收集的灰葡萄双歧杆菌种群的致病特异性； 3）灰葡萄芽孢杆菌分离物对羟基苯胺杀真菌剂苯六胺的敏感性； 4）分离株之间的分子差异及其与分离株致病性的关系。

2.材料和方法

2.1.灰葡萄孢的分离株

利用以前开发的改良选择培养基m1KERS，从不同的宿主植物（葡萄，草莓和生菜）中收集了33株灰葡萄双歧杆菌。 这种培养基的组成由以下成分（gL-1蒸馏水）组成：葡萄糖20克； 硝酸钠，1克; KH2PO4，1.2克； MgSO4·7H2O，0.2克; 氯化钾0.15克; 琼脂25克 将该介质在121°C高压灭菌20分钟。 冷却至65℃后，加入以下成分：氯霉素0.05g；氯霉素0.05g。 单宁酸5克; 硫酸铜，2.2克; Cabrio顶级杀菌剂（吡菌酯），0.1克 测试了草莓（佛罗里达州和节日酒厂），葡萄（卓越葡萄和烈酒酒厂）和生菜（巴拉迪酒厂）的不同器官对葡萄孢的感染情况（表1）。 将植物样品分别浸在无菌水中5分钟，在纸巾上干燥，然后铺在m1KERS上，在23°C孵育3-21天。 表1显示了收集分离株的位置，寄主植物和植物器官。

2.2.菌丝生长率的测定

将菌丝琼脂塞（直径6毫米）从灰葡萄孢

的3 d分离培养物的菌落边缘转移到PDA培养皿的中心（直径9厘米）。 每个分离物重复两次，并在23°C下孵育。 通过测量一周内的菌落直径，每天获得菌丝体生长速率（cm / d）。 将该测试重复两次。

2.3.致病性测定

莴苣植物（cv。Baladi）的分离叶子用于测试灰葡萄双歧杆菌分离株的致病性。 从各植物的中央部分切下叶子。 每个复制品选择四片叶子，并放在塑料托盘中的湿毛巾上。 使用灭菌的软木塞从菌丝芽孢杆菌的每个分离株的PDA培养物的菌落边缘去除菌丝琼脂塞，然后将其置于菌丝上，并使每个菌丝的菌丝体一侧面向叶表面。 每个叶子准备一个或两个插塞，每个分离株准备四个叶子。 每个托盘都覆盖有透明塑料盖，以保持较高的湿度，并在荧光灯（12 h光照/ 12 h黑暗）下于20°C的生长室中孵育。 培养72小时后，测量生菜叶子上每个菌丝琼脂塞周围的损伤直径。 将该测试重复两次。

2.4.杀菌剂敏感性测定

将Fenhexamid（Sigma-Aldrich）溶于无菌水中，将其调整为原液10 mg / ml，并在灭菌后添加至马铃薯右旋糖琼脂（PDA）（Difco，Dickinson and Company）培养基中，使浓度为0.003， 每毫升PDA培养基中含0.01、0.1、0.5、1、5、10和13 micro;g苯六胺。 对于每株灰葡萄孢菌，从四维大菌落的边缘切下菌丝体塞（6mm），并将其置于用每种杀真菌剂浓度修正的PDA皿的中心。 每个浓度使用两个平板，然后进行两次实验。 将培养物在23°C下孵育3天。 对于每个板，在两个垂直方向上测量菌落直径，减去原始菌丝体塞直径（6 mm）。 对于每种分离物，计算出50％有效浓度（EC50），该浓度是导致50％菌丝生长抑制的杀菌剂浓度。

2.5.透射电子显微镜

将灰葡萄双歧杆菌的低毒力分离株BCL29和强力分离株BCL11的菌丝琼脂塞放在培养皿（直径6 cm）中的PDA上，在23°C下孵育7 d。 从菌落边缘区域取样取这两个分离株的小块菌丝（约3times;3 mm），并固定在4°C的0.05 M甲酸钠水溶液（pH 7.0）中的2％戊二醛中。 将标本在0.2 M磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中于室温（25°C）洗涤3次，每次10分钟，然后在2 M四氧化中于0.2 M磷酸钠缓冲液中固定2 h， 然后将其包埋在硬质树脂中，然后用超薄切片机切成100纳米的超薄切片。 将切片用5％乙酸铀酰染色，并在50％乙醇中漂洗1小时。 然后，将其在分级的乙醇系列中脱水，用5％的柠檬酸铅水溶液和5％的乙酸铀酰染色，并在80 kV下用透射电子显微镜（JEOL 1200ESII）进行检查。

2.6.统计分析

回归模型和随后的EC50均使用SPSS估算[26]。 分别从病原体和菌落直径对病原性和苯六甲胺敏感性测定进行评分，并通过在SPSS中实施的方差分析（ANOVA）进行分析，以确定所研究寄主植物内部和之间的显着变异。 数据均值采用最小显着差异检验在P = 0.05的水平上进行处理。

2.7.DNA制备

将每种分离物在马铃薯葡萄糖肉汤（Difco Laboratories，Dickinson and Company）中于23℃生长7 d。 收获菌丝体，并在无菌水中洗涤，在液氮中冷冻，并冻干。 使用GeneJET植物基因组DNA提取（Thermo Scientific）提取真菌基因组DNA。

2.8.检测转座因子（Botty和Flipper）

Boty，长末端重复序列（LTR）[10]和鳍状肢，一种移动的Fot1样转座因子[11]，已从灰质芽孢杆菌中鉴定出来。 PCR引物对F300（5rsquo;-GCA CAA AAC CTA CAG AAG A-3rsquo;）和F1550（5rsquo;-ATT CGT TTC TTG GAC TGT A-3rsquo;）已用于检测鳍状元件[11]。为了检测boty元件，使用一对引物BotyF4（5-CAG CTG C​​AG TAT ACT GGG GGA-3）和BotyR4（5-GGT GCT CAA AGT GTT ACG GGA G-3）扩增LTR根据Ma和Michalilides（2005）的研究[9]。 PCR反应（TECHNE TC-3000）在25 micro;l的2X PCR Master Mix（Thermo Scientific）中进行，其中含有1 micro;M的每种引物，100 ng的真菌DNA。使用以下参数进行PCR：在95°C初始变性5分钟，然后在94°C变性40个循环1分钟，在60°C退火引物对F300和F1550或68° C对引物对BotyF4和BotyR4进行1分钟，在72°C延伸1分钟（对于boty引物）或3分钟（对于鳍状引物），最后终止于72°C延伸10分钟。使用标准方案在1.5％琼脂糖凝胶上测试和验证PCR产物。

2.9.ITS和LTR扩增和克隆

根据White的说法，使用了ITS1（5-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3）和ITS4（5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3）两种引物来扩增内部转录间隔区（ITS）。等。 （1990）[27]。而引物对BotyF4和BotyR4先前曾被用来扩增boty LTR [9]。对每个区域进行扩增，最终体积为50 micro;l，其中包含1 micro;M的每种引物，0.2 mM的每种dNTP（Thermo Scientific），带有MgSO4的1x Pfu缓冲液和2 U Pfu DNA聚合酶（Thermo Scientific），100 ng真菌DNA。对于ITS扩增，在TechneTM热循环仪中按照以下步骤进行反应：在94°C变性5分钟，然后进行35个循环，在94°C变性30秒，55°C变性30秒和72 C进行1分钟变性，退火和延伸，最后在72˚C延伸5分钟。然后将PCR产物保持在4℃。为了研究灰葡萄双歧杆菌分离株之间的差异，从随机选择的分离株中克隆了boty元件：BCG17（克隆1和克隆2），BCL2（克隆5和克隆6），BCG6（克隆5和克隆6），使用Transform Aid细菌转化试剂盒（Thermo Scientific）的BCG14（克隆1）。使用前述条件重新扩增每个克隆。

2.10.ITS和LTR测序

使用基于硅胶柱的方法（GeneJET PCR纯化试剂盒，Thermo Scientific）纯化和浓缩扩增的片段，然后通过测序服务（Macrogen Europe，荷兰）进行测序。 使用Bioedit v3 [28]编辑序列色谱图以组装序列。 单倍型序列被提交到GenBank数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。

2.11.系统发育分析

使用最大简约度（MP）分析比对的序列[29]。使用默认设置，使用PAUP * 4b10 [30]进行MP分析，并使用1000个引导重复进行评估。此外，数据通过贝叶斯推断（BI）进行分析[31]。通过JModelTest [32]确定了LTR区域的最佳核苷酸替代模型，该程序大量使用PhyML [33]。用1,000,000代进行了两次运行。每千代取样一次，并丢弃（老化）前40,000棵树，以便在链达到稳定阶段之前排除树木。使用Tracer v1.4 [34]测试了老化有效性。使用TreeGraph 2可视化树木[35]。 MEGA5进行了最大似然（ML）分析[36]。树推断选项设置为“最近的邻居交换”。缺口/缺失数据被视为部分缺失，且部位覆盖率截止值为95％。为了研究进化枝支持值，进行了具有1000个重复的自举分析。在所有方法中，都是在存在由BLAST工具（NCBI网站）找到的可用LTR序列的情况下生成树的。使用MEGA5估计两组之间的每个位点的碱基取代数（遗传距离）（埃及分离株与GenBank登录号）。使用最大综合可能性模型进行了分析。站点之间的速率变化采用伽玛分布（形状参数= 0.42）建模。分析涉及25个核苷酸序列。从每个序列对中去除所有歧义位置。

3.结果

3.1.使用m1KERS培养基分离灰葡萄芽孢杆菌种群

在m1KERS培养基上培养3-21天后，筛选了来自宿主植物的不同器官：生菜，草莓和葡萄，以检测灰葡萄孢。 在培养的第三天观察到被感染植物样品周围的棕色光晕形成的出现，表明植物样品中存在灰葡萄孢菌。 然后使用光学显微镜在形态学上鉴定所有灰葡萄双歧杆菌分离物，并将其保存在4℃的石蜡油中。

3.2.使用易位元素测定分离物类型

PCR结果显示，引物对F300和F1550已从33个分离物中的24个中扩增出预期的1250 bp PCR片段，引物对BotyF4和BotyR4从33个分离物中的28个中生成了510 bp PCR片段（数据未显示） ）。 而两个分离株却没有这两个元素（表1）。 在测试的33个分离株中，有21个具有两个转座因子，即boty和鳍状肢（转座型），这表明从所有寄主植物和植物器官分离出的几乎所有灰葡萄孢子群体中，转座分离株均占主导地位（63.6％）。 虽然有7个具有boty元素（机器人类型，占21.2％），三个具有鳍状元素（拖鞋类型，占9.1％），而两个却没有这两个元素（真空类型，占6.1％；表1）。

3.3.灰葡萄芽孢杆菌分离物的致病性

从莴苣叶上收集自不同寄主植物的30株灰葡萄双歧杆菌的致病性试验的统计分析表明，不论其位置和寄主植物如何，取决于其侵略性，这些菌株之间存在显着差异（图1）。在20°C下孵育3天后，从不同植物物种（表1）获得的30种细菌中有4种分离株（BCG3，BCS47，BCS56，BCL29）显示出对莴苣叶的低毒力（图1），而BCL11分离株从生菜茎中收集到的，表现出最具毒性的分离株（图1和图2）。灰霉病菌的强毒分离株的病斑直径变化范围为0.02至1.65 cm（图1），而从莴苣茎中收集的低毒分离株BCL29并未引起莴苣叶感染（图1和图2）。而且，如以前的报道所述，所有分离株之间的致病性没有显着差异[37]。所有的灰葡萄芽孢杆菌分离株，但其中一个为BCL2

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