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附录A 译文

生长于豆腐乳清上的猴头菌其胞内多糖的抗氧化活性和保肝能力

摘 要

通过用梯度浓度的乙醇（40%、60%和80%）对生长于豆腐乳清上的猴头菌菌丝体（HEP）胞内多糖进行分级醇沉，可以得到其多糖的三种醇沉组分（HEP40、HEP60和HEP80）。结合化学和仪器分析的方法，对三种多糖组分的理化性质进行了研究。评估三种多糖组分的抗氧化活性和保肝作用的研究表明，它们在不同的评估体系中有不同的活性表现。HEP80在体外有很强的抗氧化活性，在体内具有强大的保肝作用，而保肝作用可能正是由于其抗氧化性而产生。HEP可以用作抗氧化剂产品和预防肝病的补充剂。豆腐乳清通常被人所丢弃，但本文为有效利用豆腐乳清开辟了一条途径，今后其将受到关注。

关键词: 猴头菌；多糖；豆腐乳请；抗氧化活性；保肝作用

1 介绍

活性氧在各种严重疾病的发病机理中起着重要的作用，如神经退化性疾病、癌症、心血管疾病、动脉粥样硬化性白内障和炎症。为了满足人体对健康的需求或减少对人体的伤害，现今已经开发并广泛使用了几种合成抗氧化剂。但是，其中一些抗氧化剂被发现会损害肝脏。鉴于此，在食品、制药和化妆品工业中，人们越来越有兴趣尝试用天然抗氧化剂代替合成抗氧化剂。

几种广泛分布于动物、植物和微生物中的天然多糖已被证明可以作为自由基清除剂在预防生物体受到氧化损伤中发挥重要作用，并可作为新型有效抗氧化剂的研究方向。

猴头菌是在东亚发现的一种著名的食用和药用蘑菇。其子实体和真菌菌丝体表现出多种药理活性，包括增强免疫系统、抗肿瘤、降血糖和抗衰老特性。

豆腐是世界上主要的用大豆加工的产品。豆腐乳清是液态残渣，是在豆腐加工过程中作为副产物获得的。在加工过程中，多达30%的大豆可能因浪费而流失。每年由此产生出的大量豆腐乳清，通常被视为废物而丢弃，这样不仅是一种资源的浪费，而且造成了环境污染。因为豆腐乳清具有很高的有机质含量，可以用这种大量的生物废物来培养菌种以产生多糖。

本实验的目的是研究豆腐乳清上生长的猴头菌（HEP）菌丝体中胞内多糖的抗氧化性和保肝能力，还研究了化学性质和上述活性之间的关系。

2 实验

2.1材料和试剂

本研究中使用的豆腐乳清是从中国浙江省杭州市的豆腐工厂中获得的新鲜原料。豆腐乳清的平均组成如下（g/100g）：总蛋白0.82；脂肪0.39；灰分0.46；水分95.9；糖类和少量内化合物2.43。豆腐乳清的pH在4.1到4.3之间变化。

脱氧核糖，1,1-二苯基-2-吡啶并肼基（DPPH），3-（2-吡啶基）-5,6-二苯基-1,2,4-三嗪-4,4-二磺酸一钠盐（二茂铁），丁基 羟基茴香醚（BHA），三氟乙酸（TFA），乙二胺四乙酸（EDTA），1-鼠李糖，D-葡萄糖，D-木糖，D-岩藻糖，D-半乳糖和D-甘露糖。均购自西格玛化学有限公司（美国密苏里州圣路易斯市）。使用的所有其他试剂均为分析纯。

2.2猴头菌多糖的制备

2.2.1 猴头菌的培养

猴头菌的菌株是从中国微生物总菌保藏中心获得的。将其培养在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）中，保存在4°C下，每3个月进行再次培养。种子培养物在250 ml烧瓶中成长，其中装有100 ml含有（g/l）：葡萄糖20，酵母提取物5，蛋白胨3，磷酸二氢钾1和硫酸镁1的培养基。将烧瓶放在25°C的蒸馏水中浸泡培养，前12 h无需摇动，然后以140 rpm的速度震荡培养4天。将体积为5 ml的的接种培养物压碎，并在无菌环境下添加浸没到培养物中。浸没培养是在装有95 ml豆腐乳清（pH=5.2）和葡萄糖（5 g/l）的250 ml烧瓶中于25°C的旋转摇床（150 rpm）上进行的，历时6天。

2.2.2 粗制HEP的制备

通过滤纸过滤法从液体培养基中收获得猴头菌菌丝体，用蒸馏水洗涤3次，并在60°C下干燥至恒重。用搅拌机将干燥的菌丝体进行研磨，在95°C下用蒸馏水提取3次，每次2 h，然后在5000 times;g（离心力）的离心机中离心15 min。合并上清液，在减压环境下用旋转蒸发仪浓缩至原始体积的1/5。如此获得的样品（多糖），用浓度分别为40%、60%和80%的乙醇进行分级醇沉，得精制醇沉组分命名为HEP40，HEP60和HEP80。将样品通过溴化钾（KBr）沉淀法在傅里叶变换红外光谱仪（FT/IR-660 Plus，JASCO）上进行分析和测定，测量范围为400-4000 cm^-1。

2.2.3 单糖成分分析

将含有多糖（2 mg）的样品在110°C下用2 M三氟乙酸溶液水解2 h，并使用配备碳水化合物分析柱（3 mmtimes;150 mm）的色谱仪用高效阴离子交换色谱法（HPAEC）测定其单糖的组成成分。用2 mm氢氧化钠洗脱柱，并使用色谱仪检测器监测单糖。

2.2.4 化学性质分析

粗多糖的产率计算为所用样品总重量的百分比。总糖含量通过苯酚-硫酸法测定。糖醛酸含量通过改良的羟基二苯基测定法测量。使用Bradford法以牛血清蛋白为标准品测量蛋白质。

2.3 抗氧化活性的测定

2.3.1 DPPH自由基清除活性

用Shimada等人报道的方法来测定自由基清除能力，向每1 ml样品溶液中加入1 ml新鲜制备的含有DPPH（0.5 mM）的甲醇二甲基亚砜（DMSO）溶液，充分混合，然后在黑暗中以室温放置30分钟。在517 nm处记录所得物的吸光度值。BHA被用作参考材料，所有测试均一式三份进行，清除活性的计算公式如下：

清除活性(%)= times;100

其中A₀是对照（无样品的DPPH溶液）的吸光度，A₁是样品（有样品或阳性对照的DPPH溶液）的吸光度。

2.3.2 亚铁离子螯合活性

所有样品的铁螯合能力通过提取物和标准品对亚铁离子的螯合来确定，并通过Dinis等人的方法进行估算。为此，将0.2 ml不同浓度（0.1–5.0 mg / ml）的测试样品添加到2 mM FeCl₂（0.05 ml）的溶液中，通过添加5mM铁嗪（0.2ml）来引发反应，并将混合物剧烈摇动并在室温下静置10分钟。混合物达到平衡后，在562 nm下测量溶液的吸光度。使用以下公式确定铁-Fe² 复合物形成的抑制百分比：

螯合活性(%)= times;100

其中A0是对照的吸光度，A1是样品的吸光度。对照包含FeCl2和菲洛嗪，具有复杂的分子结构。EDTA用作阳性对照。

2.3.3 还原能力测定

用Oyaizu法测定所有样品的还原电位。将不同浓度的测试样品（0.1-5.0 mg/ml）与磷酸盐缓冲液（2.5 ml，0.2 M，pH=6.6）和铁氰化钾（2.5 ml，1%）混合。将混合物在50℃下孵育20分钟，并将一部分（2.5 ml）的三氯乙酸（10％）加入混合物中，然后进行离心分离（10 min，1000times;g）。将溶液的上层（2.5 ml）与蒸馏水（2.5 ml）和FeCl3（0.5 ml，0.1％）混合，在700 nm下测量吸光度。

2.3.4 羟基自由基清除率测试

根据Smirnoff的操作方法测量了多糖组分对羟基自由基的清除率。为此，将0.5 ml FeSO₄（1.5 mM）与0.35 ml H₂O₂（6 mM），0.15 ml水杨酸钠（20 mM）和1.0 ml样品（0.1–5.0 mg/ml）混合，然后在37℃下孵育1 h。在562 nm处测量羟基化水杨酸酯复合物的吸光度，BHA用作阳性对照。通过以下公式计算抗氧化活性：

清除率（%）= times;100

其中，A0是溶剂对照的吸光度，A1是测试物（样品或BHA）的吸光度。

2.4 体内保肝活性

2.4.1 CCl₄诱导的小鼠肝毒性测试

本实验使用60只体重20-22 g的雄性ICR小鼠（购自浙江大学医学院动物实验中心）。将动物以12:12 h的光：暗，循环圈养在空调房间内单独的不锈钢笼中。在整个实验过程中提供小鼠商业颗粒饲料和水，所有程序均按照中华人民共和国关于实验动物的使用和护理的第8910MO047号法规进行，并遵循浙江大学实验动物研究所制定的指导原则。

将小鼠分为六组（每组10只）。给第I组（正常对照组）的动物每天服用单剂量的水（16 ml/kg体重比例，口服），持续7天，并在第7天接受花生油注射（10 ml/kg体重比例，腹腔注射）。给第II组（CCl₄对照组）服用水（16 ml/kg体重，口服），每天一次，持续7天，并在第7天接受花生油中的0.1％CCl₄注射（10 ml/kg体重比例，腹膜内）。给第III组（阳性对照）动物投喂标准水飞蓟素（一种通常用于治疗肝脏疾病的药物，剂量为100 mg/kg体重，口服），每天一次，持续7天。给IV-VI组的动物投喂HEP40，HEP60和HEP80（每天一次，分别以300 mg/kg的比例给药），持续7天，并在第7天时给与其飞蓟素和HEP，在给药1 h后接受花生油中的0.2％CCl₄注射（10 ml/kg体重，腹腔内注射）。处理后在24小时内将所有动物处死，并立即收集血样，取出肝脏用于生物研究。

2.4.2 生化分析

将采集的血样以4000 times;g离心15 min，以获得用于评估天冬氨酸转氨酶（AST）和丙氨酸转氨酶（ALT）的血清。将用于生化研究的肝组织在9倍体积的冰氯化钠（0.9％）中匀浆，然后将匀浆液以6000 times;g离心10 min，以产生用于分析超氧化物歧化酶（SOD），丙二醛（MDA），谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和过氧化氢酶（CAT）的澄清上清液成分。所有评估均使用南京建城生物技术研究所（中国）提供的标准试剂盒进行。

2.5 统计分析

所有实验均一式三份进行，数据表示为平均值plusmn;标准偏差，并使用单向方差分析（ANOVA）进行统计分析。通过学生的t检验评估了两组之间差异的统计显着性。所有计算均在SAS 9.0中进行。当Plt;0.05时被认为具有统计学意义。

3 结果与讨论

3.1 多糖的组成和特征

以从豆腐乳清上发酵的猴头菌菌丝体为原料，通过沸水提取法、乙醇分级沉淀得到的产物，将其用水蒸馏并在冷冻干燥设备中冻干，最终获得三种称为HEP的水溶性多糖组分。HEP的总产率为干燥材料的约6.23％（w/w），即HEP40为2.43％，HEP60为3.06％以及HEP80为0.74％。HEP40、HEP60和HEP80的化学成分包括碳水化合物、蛋白质和糖醛酸的含量如表1所示。HPAEC分析显示，三种多糖均由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖和岩藻糖七种单糖组成。葡萄糖和半乳糖是主要的单糖（图1）。

3.2 傅里叶变换红外光谱分析（FTIR）

FTIR光谱通常用于定性测量有机官能团，特别是-OH、-NH和-CO。图2显示了用豆腐乳清发酵的猴头菌菌丝体中三种多糖组分的FTIR光谱。在3300–3500 cm^-1和2927–2930 cm^-1处分别有-OH和饱和-CH的拉伸振动。其中归属于酰胺的条带为两条，一条为酰胺I（对于-CO）在1640 cm^-1处，另一条为酰胺II（对于-NH）在1440 cm^-1附近的条带，表明这三种多糖具有聚合蛋白。1000–1200 cm^-1处的吸收带表明这三种多糖在其结构中均含有吡喃糖单体。

3.3抗氧化活性

3.3.1 DPPH自由基清除活性

DPPH自由基是一种稳定的自由基，可以接受电子或氢基自由基而成为稳定的抗磁性分子，已被广泛用做评估抗氧化剂的自由基清除活性的工具。DPPH的酒精溶液在517 nm处具有最大的特征吸收峰。清除DPPH的方法是基于提供氢的抗氧化剂的存在，还原DPPH乙醇溶液，从而通过反应形成非自由基形式的DPPH-H。在检测时，它可以在短时间内容纳许多样品，并且其灵敏度足以检测低浓度的活性成分。

基于此原理，测量并监测了HEP40、HEP60和HEP80对DPPH自由基的清除活性（如图3a）。多糖对于DPPH自由基的清除活性与样品浓度有关，此外，测试样品的DPPH清除活性随浓度的增加而显著增加。在1.25 mg/ml的浓度下，HEP40、HEP60、HEP80和BHA的清除效果分别为43.01％、31.50％、59.95％和98.78％。上述结果暗示这三种多糖可能充当电子或氢基供体以清除DPPH。

3.3.2 铁螯合能力

铁螯合剂可以通过延迟金属的氧化而发挥重要的抗氧化作用。有效的铁（II）螯合剂还可以通过去除可能参与生成-OH的Fenton型反应的铁（II）来提供对于抗氧化损伤的保护。通过抑制活性氧的产生和脂质的过氧化，使铁（II）的含量最小化以提供抗氧化损伤的保护。待测样品的铁（II）螯合能力是通过测量铁-铁锌络合物来确定的（图3b）。在0.1–5.0 mg/ml的浓度下，HEP40的螯合能力为8.41–97.07％，HEP60的螯合能力为5.31–37.52％，而HEP80的螯合能力为7.07–43.99％，EDTA则为28.20–99.44％。根据实验人员的报告得出，-OH的清除活性不是直接清

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