通过从红树林土壤中分离出来的耐盐芽孢杆菌来还原亚硒酸盐变成红色单质硒并且研究这些物质的特征外文翻译资料

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通过从红树林土壤中分离出来的耐盐芽孢杆菌来还原亚硒酸盐变成红色单质硒并且研究这些物质的特征。

摘要：两株革兰氏阳性菌，BSB6和BSB12，通过生物化学特征和16s RNA分析显示从红树林土壤中分离的菌株对在耐盐26之间的四价硒的减少具有抗性。它们两个菌株都是严格好氧菌并且可以广泛生长在pH为4-11的条件下，在温度为4-40℃，盐浓度为4%-12%之间有一个最佳生长条件即生长在温度为37℃，pH为7.5和盐浓度为7%的条件下。BSB6和 BSB12的生物化学特征和16s RNA序列分析显示最接近的系统发育与巨大芽孢杆菌相似。菌株有效的减少四价硒的含量和完全还原亚硒酸盐（高达0.25 mM）在40小时之内就可以完成。通过扫描式电子显微镜和X射线色散谱以及横向电磁场的研究揭示了纳米大小的球形硒粒子的形成和在细菌细胞也得到了共焦显微图研究的支持。紫外可见漫反射光谱和X射线衍射对硒元素沉淀的分析透露在自然界中硒粒子以纳米级的晶体存在。这些菌株可以进一步利用硒在相对较高盐浓度下的生物修复过程绿色合成硒纳米粒。（2011年 爱思唯尔有限公司 保留所有权限。）

1. 介绍

与一些相对较小的价值来比较的话，低浓度的硒对人体和动物是至关重要的，有很重要的意义，但是高浓度的硒对人体和动物则有害（弗迪斯 2005）。硒的减少形式发生在不同的电解状态下（硒化 Se^2-），移动元素硒（Se⁰）和水溶性硒酸（SeO₃^2-）/亚硒酸盐含氧阴离子（SeO₄^2-）。水溶性硒的主要来源农业废水和热发电站，炼油厂，熔炼厂、玻璃生产、颜料和半导体行业中。因此有必要开发出合适的方法来减少这些含氧阴离子硒废水，限制他们排入到水生环境中。除了物理化学方法如化学沉淀,催化还原和吸附/离子交换等方法可以处理剩余的硒污染水外,还有几个报告描述了细菌可以把硒酸盐还原成亚硒酸盐或者价态低的无毒元素硒,这样可以形成一个可行的和成本有效的方法来消除过剩的硒污染水。各种各样生长在不同的陆地和水生环境中,富硒和缺硒土壤中的细菌有能力减少亚硒酸盐和含氧阴离子硒酸盐。然而,潜在的耐盐细菌还原亚硒酸或硒酸和在高盐浓度还原其他阴离子的细菌相对少了。

红树林是一个典型的肋生态区位于陆地和海洋之间的过渡区域。周期性潮汐洪水使红树林的盐分和营养成分含量变高,因此支持不同的水生群体基因的生长和陆地微生物功能的应用潜力。不论是嗜盐的还是耐盐的微生物在在生理盐水的环境中都适于盐碱土壤生物修复和生物矿化，因为他们能够生长在高盐浓度的条件下。在不同组的细菌，革兰氏阳性菌和芽孢杆菌具有良好的表现在盐碱环境中，然而微球菌在盐碱环境中占主导地位。它也被报道,耐盐杆菌与其他不耐盐菌株相比有更大的潜在的生物功能。

保持上述观点，目前的工作是为了从生物多样化的盐碱环境中的红树林土壤分离出耐盐菌株和具有高Se（Ⅳ）抗性的菌株。本研究报告确定了两株菌株还原四价硒减少四价硒含量并且通过各种物理化学方法降低产品的特性。

2材料和方法

2.1试剂

用于目前研究的所有的化学品，试剂和微生物培养基试剂均为分析纯。琼脂和肉汤用来提供营养物质。250 mg/L 的亚硒酸原液是用Na₂SeO₃ ·4H₂O溶解在双重蒸馏水中得到，0.5M的试剂是通过密度为1.14的3.5豪升的母液用蒸馏水稀释到100毫升。硫酸和硝酸通过默克公司买来得到。

2.2位置描述，样本收集和分离细菌。

红树林位于肯德拉帕拉区延伸约139.39平方公里的奥里萨邦的三角洲地区。从红树林土壤收集来的样本，放在密封的无菌聚乙烯包装袋里带回实验室里。测量样本土壤中的pH值和电导率分别使用数字式酸度计(Systronics,361)和电导仪(Systronics,308)。发现土壤样本中的pH和电导率的范围分别为5.9-7.5和13.0-17.3 mS cm^-1。细菌在NA培养基（g L-1：蛋白胨，5.0；氯化钠，3.0；牛肉膏，3.0；琼脂，1.8）中分离出来，并且后续在pH为7.0和含盐量为4-12%平板上进行稀释涂布平板技术。

2.3 定性筛选分离细菌和分析细菌的生长

亚硒酸抗性的定性筛选是为了进一步研究鉴别出最有效的分离方法。对于在pH为7.5并且加入浓度为5 mM亚硒酸钠的这个NA培养基中接种不同的菌株。培养基放在37 ℃下培养48 h。该细菌菌落周围的橙红色或者红色的强弱被作为亚硒酸钠还原成单质硒的效率。当两种细菌分离后，BSB6和BSB12两种菌株菌落周围中的色彩更鲜艳的被选择用于进一步研究其表征和硒还原的评估。生长在不含亚硒酸钠的NA和NB培养基中的BSB6和BSB12两株菌株被用来在37℃，pH为4-9和不存在或者存在 食盐（4-12%）或者海盐（5-15%）的条件下进行研究。

2.4细菌菌株的表征和16 S rDNA的测序

按照标准方法分析BSB6和BSB12在文化，形态，生理，生化和各种抗生素的选择的表征特点。部分16 s rDNA的测序是使用ABI 3130 xl分析仪来完成的，该方法基于印度，昌迪加尔，桑格研究所的双脱氧法终止方法等微生物技术。获得的序列使用局部相似性基本查询工具进行分析。最好的匹配序列从数据库中检索，同样性和相似性使用Clustal_X程序(汤普森等 1997)进行分析。系统发生树在程序MEGA5中以最大简约方法构建（Kumar等，2001）。得到的树形拓扑结构通过引导分析重采样500的基础上评估。

2.5亚硒酸的还原（SeO₃^2-）

硒还原的测定在100 mL NB培养基中进行即从在37℃的培养箱中培养的250 mL静态培养的锥形瓶中取出。BSB6和BSB12菌株在pH为7.5，温度为37 ℃的NB培养基培养8 h，培养后的菌液在4℃，8000g的冷冻高速离心机中离心10分钟，把离心后的沉淀用pH为8.0的Tris–HCl 缓冲液进行悬浮。将100 mu;L的细胞悬浮液接种到100 mL含有0.05-2 mM SeO₃^2-的培养基中。在一个固定的硒浓度比如2.0 mM，分别将pH和盐浓度在4-10和4-12% w / v的范围内进行改变。不同时的进行控制亚硒酸钠含量的实验。隔一定的时间，从每个烧杯中取出2 mL的培养物并且在10℃，10000g的高速离心机中离心10 min，取出上清液，对上清夜中剩余的四价硒含量进行定量分析。

硒包含在上清液和沉淀相是确定的。SeO₃^2-在上清液中的含量，可以使用0.05 M 的2-巯基乙醇作为还原或者络合剂的条件下用紫外分光光度计进行估计。对于估计硒的减少量，可以分析得出离心后的沉淀与硒颗粒有关联，经过去离子水洗涤的硒用10 mL的硝酸和0.5mL 的硫酸混合液硝化5分钟，接着在在100℃下用6 M的盐酸还原硒30分钟。经过酸硝化的硒可以通过上述测定剩余硒酸盐的方法进行测量。

2.6还原硒的描述

与细颗粒相关的细菌细胞，在最佳pH为7.5，温度为37℃和含有0.25 mM的亚硒酸盐的条件下培养48 h，然后通过聚碳酸酯微孔过滤器（0.22 mu;M）过滤，用pH为8.0的Tris–HCl 缓冲液重复洗涤三次，最后固定在含3%戊二醛的0.1 M，pH为7.4 的磷酸盐缓冲溶液中。将悬浮液放入到4.0plusmn;0.1℃，10000 g的高速离心机中离心10分钟，取出后沉淀物用Tris-HCl缓冲液洗涤，随后再用去离子水洗涤三次。样品用70%的乙醇进行脱水，并且在200千伏的SEM下进行检测。元素硒的分析和能量色散的微量分析同时进行。把在有0.25 mM的亚硒酸钠存在的培养基中培养48h的培养物进行离心，随后用pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤沉淀三次，后用1mL固定液（2.5%戊二醛和%甲醛把离心物悬浮，并且放在4℃下保存6 h。固定相或者固定液通过离心的方法除去。然后将细胞沉淀物用磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）洗涤五次，最后再悬浮于1 mL磷酸盐缓冲溶液中。将细胞悬浮液按照5mu;L进行等分，然后放入到在400目铜网格中，并允许在干燥器中过夜干燥。整个细胞的显微镜成像，是在200千伏加速电压的FEI飞利浦莫干268D透射电子显微镜中国执行。激光共聚焦显微镜（CLSM）的进行使用了共聚焦显微镜（卡尔蔡司，LSM7 MP，德国）。细菌菌株的这一个滴菌液放在玻璃板得到生物膜。把1.0 mu;L 的荧光试剂（罗丹明B）仔细涂抹在生物膜的顶部。在室温黑暗条件下反应30分钟后，通过用磷酸盐缓冲溶液冲洗四次而除去过量染色溶液。记录的数据是在激发波长为488 nm和发射波长为515 nm处的测量数据。还原物粉末的X射线衍射图像记录在使用CuKalpha;辐射飞利浦PW3710 X射线衍射仪中。

3结果与讨论

3.1分离，描述和细菌分离鉴定。

共有26株细菌菌株分别从用添加5-15％的NaCl（重量/体积）的NA培养基，奥里萨邦的红树林采集的土壤样品中分离。耐盐性的筛选表明，这些菌株在食盐（4-12％）和海盐（4-15％ 重量/体积）的范围具有相对高的容差。然而，它们在无盐环境中生长的能力把它们分到中度耐盐的菌株组中（弗雷兰，1987）。基于对硒（IV）的耐受性的定性筛选，2株菌株即BSB6和BSB12即表现出更大的亚硒酸钠抵抗性，并且通过还原物质的表型和分子特征以识别它们，将得到的结果总结在表1中。两个菌株都是需要氧气的革兰氏阳性菌，椭圆的内生孢子的胶状菌落直径为2.0-3.5 mu;m。这两个菌株在过氧化氢下十分活跃，在有硝酸盐和有氧酸的条件下还原代谢形成葡萄糖但是有阴性吲哚生成。菌株的氧化酶试验结果如表1所示。菌株为阴性脲酶和阳性淀粉和明胶水解和它们利用的碳源如D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-果糖和蔗糖，但不用D-甘露醇和D-木糖和柠檬酸见表1。该菌株对所有标准抗生素敏感除制霉菌素外。像氧化酶，厌氧生长，酸和不同的糖酶，蛋白酶，淀粉酶，脂肪酶，甲壳素，硝酸盐还原，有机碳源，对抗生素的敏感性，没有发酵形成的气体的生理生化特性等（如表1）进一步证实菌株属于芽孢杆菌属。（斯尼斯，1986）。两种品种均能够在pH为7.0-11.0最佳为7.5的范围内，温度为4-40℃最佳37℃和盐浓度为4-15％最佳7％盐浓度的条件下生长。在NB培养基中，在三小时内程缓慢生长形式，在接下来的4-14小时程不稳定的幂数形式生长但是相对来说是固定的。如图1所示。而且品种鉴定是由16S rDNA序列完成。通过系统发育树分析，基于所述的最大简约算法，表明两菌株（BSB6和BSB12）的分支与巨大芽孢杆菌分别具有100%和97%的相似性。如图2所示。两个菌株的16S rDNA的同源性表明，这两种菌株可以是巨大芽孢杆菌的不同菌株在其基因组中的一些差异造成的。两种菌株，BSB6和BSB12，分别用MTCC数字MTCC-9204和MTCC-9205沉积在微生物菌种保藏中心，昌迪加尔（印度）。菌株的16 s rDNA序列提交并且加入数字FJ853653和FJ973576基因库。值得一提的是，巨大芽孢杆菌是奥里萨邦的盐水红树林生态系统中一个新报告的菌种。此外，它是与用于工业和环境应用潜力的理想细菌。细菌基因组中可能包含具有有用的生物修复潜在几个异常代谢基因。

表1

两个细菌菌株表型特征

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