枯草芽孢杆菌 B-332 菌株发酵条件的研究外文翻译资料

 2022-10-08 11:47:23

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枯草芽孢杆菌 B-332 菌株发酵条件的研究

刘雪 1*，叶婧 1，穆长青 2，朱昌雄1 （ 1.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，

北京 100081；2. 北京市植物保护站 ，北京100029）

摘 要: [目的]探明生防菌株枯草芽孢杆菌B-332 的发酵条件及培养基配方。 [方法]采用单因素和正交试验设计，通过摇瓶培养对枯草芽孢杆菌B-332 菌株的发酵培养基和培养条件进行优化。 [结果] 最适培养接种时间为18h，优化后的培养基配方为：豆饼粉 0.60 g/L、蔗糖0.25 g/L、硫酸铵0.07 g/L、 柠檬酸三钠0.03 g/L、磷酸氢二钾0.003 g/L、硫酸镁0.005g/L、硫酸亚铁0.000 5 g/L；发酵条件为：温度30℃、摇床转速180 r/min、摇瓶装量 80 ml/500 ml。在该综合条件下，发酵后的芽孢数为1.43times;10^11cfu/ml，比初始条件的芽孢总数4.03times;10^9 cfu/ml提高了34.48倍。[结论]该研究为枯草芽孢杆菌B-332 菌株的工厂化打下了基础。

关键词：枯草芽孢杆菌；发酵条件；发酵培养基；优化

研究已经完成对益生防菌枯草芽孢杆菌B-332的最佳培养基配方和发酵条件的研究，并扩了对大生物防治菌株,品种和对稻瘟病的研究，奠定了工厂生产菌株的工艺研究的基础。由由枯草芽孢杆菌产生的抗菌物质可控制多台植物病原真菌和细菌，如胡瓜钝绥螨的水稻纹枯病，轮纹病和伪玛纳斯菌等，在中国和日本DB9011菌株枯草芽孢杆菌菌株B3的体内生物杀菌剂产品已推广应用。枯草芽孢杆菌的孢子具有非常巨大的休眠能力，其可在一般条件下维持几年活力几十年，并适合于存活和活细菌剂的保存。我们小组以前的研究表明，孢子和芽孢肝菌的抑菌提取物，对枯草 B-332抗稻瘟病具有良好的控制效果，两种药物混合应用程序的控制效果可达75.5％以上。据对应变的有效生物防治效果，并结合抗逆性强，易储存的特点孢子，作者通过B-332株的孢子数量以判断发酵条件的主要指标，并采取了抗菌提取物作为补充指示符的内容，从而解决摇瓶发酵培养基和条件为应变的优化。

基金项目: 国家水体污染控制与治理科技重大专项“受农业面源污染入湖河流污染控制与生态修复技术及工程示范课题 ” (2009ZX-07103-002)；“ 十一五 ”国家科技支撑计划项目“ 城乡统筹农村 生活 垃圾污 染控 制技 术与 示范”（ 2009BADC2B00-02） 。作者简介 刘雪（ 1981- ） ，女，黑龙江哈尔滨人，助理研究员，研究方向：环境科学。 通讯作者。

收稿日期 2012-10-08

修回日期 2012-10-29

材料与方法试验菌株

枯草芽孢杆菌B-332在测试中使用了由环境研究所环境修复实验室和可持续发展农业，并放在中国农业科学院保存。

试验方法

活细菌和孢子的计数方法

运用平板倾倒计数法作为活的细菌数量的计数方法，结晶紫染色法被用来作为应变的孢子率的计数方法。

细菌的生长曲线的测定

将B-332菌株接种在肉汤培养基（生化试剂，北京生化试剂公司）（100毫升/500毫升）中，并在37℃下进行发酵培养，220转/分钟。将样品培养之后取为6，9，12，15，18，21，24,27，30，33和36小时，和10毫升的样品各采取一次。在600nm波长细菌液体的吸收值通过光电比浊法测定。以时间为横轴，以细菌浓度（OD600）为纵轴，绘制细菌的生长曲线。

初始发酵培养基的筛选

据相关文献的8种枯草芽孢杆菌发酵配方进行了确定。在肉汤培养基中的细菌被采纳作为种子发酵液，并和12小时培养的种子发酵液接种到下列根据5％接种8种媒体（100毫升/500毫升，37℃，220转/分）量，并进行了72小时的发酵培养。具有最高孢子数量的平台式被选定为B-332株的发酵的初始发酵培养基。

（1）第一培养基：淀粉0.15％，葡萄糖0.5％，尿素0.1％，磷酸氢二钾0.3％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.05％，酵母提取物0.02％，氯化铁0.01％，碳酸钙0.01％，大豆饭后1％硫酸锰溶液0.1％，3.08％的浓度，p H7.0-7.2。

（2）第二培养基：豆粉5％，蔗糖2％，硫酸铵1.5％，柠檬酸三钠0.25％，磷酸氢二钾0.03％，硫酸镁0.05％，硫酸亚铁0.0005％，P H7.0-7.2。

（3）3号培养基：牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，葡萄糖1％，氯化钠0.5％，淀粉0.3％，硫酸锰溶液0.1％3.08％浓度，P H7.0-7.2。
（4） 第四培养基：淀粉0.5％，尿素0.2％，磷酸氢二钾0.6％，磷酸二氢钾0.3％，酵母提取物0.04％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.02％，豆酱1％，P H7.0-7.5。

  1. 第五培养基：葡萄糖1％，硫酸铵0.15％，酵母提取物0.01％，氯化钾0.01％，硫酸镁0.01％，磷酸二氢钠0.01％，碳酸钙0.1％，P H7.5。
  2. 6号培养基：葡萄糖5％，酵母提取物1％，大豆粉6％，碳酸钙0.7％，磷酸氢二钾4％，pH7.0-7.2。
  3. 7号培养基：葡萄糖1.5％，淀粉0.2％，大豆粉3％，硫酸锰0.1％，磷酸二氢钾0.15％，硫酸镁0.05％，酵母提取物0.02％，氯化铁0.01％，碳酸钙0.01％，对H7.0-7.2。
  4. 8号培养基：麦麸1％，豆粉1.5％，硫酸铁0.03％，磷酸二氢钠2.7％，磷酸氢二钠3.5％，碳酸钙0.1％，硫酸镁0.03％，第H7.0-7.2。

精子数量的种龄和接种量的影响

五种接种量的测试设置，包括2％，5％，7％，8％和10％。种子发酵液培养，按照5％接种体积按12，15，18，21，24和27 h的接种时间到初始培养基，在37℃培养，220转/分72小时，确定精子的数量。
培养基成分的正交优化

将初始培养基的主要成分筛选出来，磷酸二氢钾，硫酸镁，硫酸亚铁，被选为常量因子，豆粉，葡萄糖，硫酸铵和柠檬酸三钠被选定为测试的因素;各试验因子有3个级别，即豆粉0.4，0.5，0.6克/升，蔗糖0.15，0.2，0.25克/升，硫酸铵0.03，0.05，0.07克/升，柠檬酸三钠0.02，0.025，0.03克/升;L9（4sup3;）正交表被选择以优化试验;种子培养基接种成8种媒体根据最佳种子年龄和最佳接种量（100毫升/500毫升，37℃，220转/分），72小时培养后，测定孢子数量。

发酵条件正交试验

每个条件具有2梯度如下：转动速度，180和220转/分;温度，30℃和37℃;装载量中，加入80ml/ 500和100ml/500毫升。L 4（3sup2;）的正交表被中优化实验，并且具有最大孢子数量的发酵条件被选为最终的优化条件。

摇瓶发酵代谢曲线的测定

对B-332菌株下优化发酵培养基和条件培养，将样品取每12小时一次，直到96小时。的P H值，残糖，氨基氮，细菌数，孢子率，在发酵过程中的抗菌粗提取物的含量进行测定，以便确定这些物质与发酵时间和发酵周期的变化趋势。有效的抗菌物质粗提物含量化学测定方法测定;发酵液的残糖是由3，5-二硝基水杨酸法测定;发酵液的氨基氮是由甲醛滴定氨基氮法测定。

图 1 通过摇瓶培养的生长曲线

图2：不同的培养基配方 图3： 种龄对枯B-332 图4：不同的接种量对枯草芽孢

对枯草芽孢杆菌B-332 的孢子数量的 杆菌 B-332的孢子数量的

的孢子数量的影响 影响 影响

结果

摇瓶菌种的生长曲线分析测定结果

如图1所示，枯草芽孢杆菌B-332的生长和繁殖，可以分为4个阶段：0-6小时，延迟相位; 6-12小时，对数生长期;15-34小时，稳定期;24-36小时，下降阶段。在稳定期细菌的吸收值（600 nm）的1.5和1.6，生长速率常数为0，以及生产菌的达到峰值之间变化;因为在下降阶段的细菌的营养物耗尽，和营养成分的比例失调，从而使有害代谢物的积累，以及细菌细胞逐渐下降，自溶;细菌出现了负增长，自溶现象，这是不适合作为种子。因此，稳定的阶段被采纳为时间范围，探索种子的年龄。

基本发酵培养基组合物的筛选

如图2所示，由2号培养基发酵产生的孢子数量是最大的，是2.02times;10 ^ 9 CFU /毫升。由等7种媒体产生的总孢子数量明显低于p在二中roduced。与8号和2号的媒体发酵产生的孢子数量是最接近的，是1.55times;10 ^9cfu/毫升。因此，2号培养基配方被选定为初始培养基。

种龄的孢子数量的影响

如图3所示，所产生的孢子数量相差不大时，种子年龄为12-27小时产生的孢子数量是最大的种龄为18小时，约为7.2times;10^8 CFU/毫升;制备的孢子数量最低作为种年龄为12小时;孢子的数量为约6.2times;10^8 CFU/ ml的作为种子年龄为27小时，这也是比较小的，因为细菌已在27 H进入衰退阶段，无法在新的平台主要生长。因此，18小时被确定为最佳的种子的年龄。

精子数量的接种量的影响

图4表明，与接种量的逐渐增加，孢子数量也不断增加;当接种量为10％，总孢子量为4.05times;10^9 CFU /毫升。接种量的体积曾与细菌的特性，种子质量和发酵条件的关系，并针对不同的微生物发酵接种量也不同;10％的接种量在发酵过程中比较高，并且大量接种过发酵明显的优点，它不仅可以缩短细菌的延迟IME使生产周期来提前时间，也降低了通过速度和变化可能性。但是，过大的接种量可能会导致提前中等养分耗尽，所以帽子代谢产物的合成量及孢子数量减少。因此，10％的接种量被确定为最佳的接种量。

表1：4个主要的组成部分影响培养基上孢子数量

因素

编号

A

豆粉// g/L

B

蔗糖//g/L

C

硫酸铵//g/L

D

柠檬酸钠//g/L

总精子数量

times;10^9 cfu/ml

CK

0.50

0.20

0.05

0.025

4.03

1

0.40

0.15

0.07

0.025

12.70

2

0.50

0.15

0.03

0.02

4.43

3

0.60

0.15

0.05

0.03

4.71

4

0.40

0.20

0.05

0.02

15.90

5

0.50

0.20

0.07

0.03

2.27

6

0.60

0.20

0.03

0.025

5.97

7

0.40

0.25

0.03

0.03

21.00

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