急性髓细胞样白血病中的DNMT3A突变外文翻译资料

 2022-10-08 11:49:41

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急性髓细胞样白血病中的DNMT3A突变

背景

对于大多数患有急性髓系白血病的患者来说负责不良结果的基因的改变是未知的。

方法

用大规模并行DNA测序法，我们在一个有着正常核型的AML患者细胞基因组中发现了一个由DNMT3A引起的体细胞突变，此DNMT3A编码一个DNA甲基转移酶。为了确定频发突变率，我们测序了另外的280例初次患AML病人的外显子中的DNMT3A。

结果

281个患者当中有62个的DNMT3A突变像之前所预料的那样会影响蛋白质的翻译。我们发现了18个不同的最常见的无义突变，它们像之前所预料的那样会影响R882氨基酸（样本容量为37个患者）。我们在DNMT3A中也发现了六个移码突变，六个无义突变和三个剪接突变 以及1.5Mbp的片段缺失，这些突变聚集在具有中度风险细胞核型的患者中（在166个病患中有56人存在以上突变，或者说突变概率为33.7%），但是在所有79个有利风险细胞核型病患中这些突变是不存在的（即对此二种比较，Plt;0.001）。DNMT3A突变病人的中位生存期明显比没有此突变的病人要短（12.3个月vs41.1个月，Plt;0.001）。排除年龄因素，DNMT3A突变与中度风险细胞核型或者FLT3基因突变的病人所出现的不良预后有关，且在Cox比例风险模型中DNMT3A突变与不良预后有独立相关性。

结论

对于中度风险细胞核型初患AML的病人，DNMT3A突变有高频发突变率，并且与不良预后有独立相关性。

全序列基因组测序对于发现体细胞中肿瘤基因的变化是一个很公正的方法。我们最近报道了两名带正常核型的AML患者的DNA测序结果和基因组分析结果。我们在DNA测序研究中没有发现新的复发突变，但是在基因组分析研究中，于编码异柠檬酸脱氢酶1的IDH1基因上发现了频发突变。后续研究已经证实并拓展了此发现，表明具有中度风险细胞核型病人的IDH1和相关联的IDH2基因有高频率的突变，这些基因的突变与一些亚群病人的不良预后有关联。测序技术的改进促使我们用更深层次的序列覆盖重新评估了第一个案例，在此期间，我们在DNA甲基转移酶基因DNMT3A中发现了一个移码突变。

人类的DNMT1，DNMT3A和DNMT3B编码DNA甲基转移酶，编码的酶可起催化作用，将甲基连接到CpG二核苷酸的胞嘧啶上。集群的CpG岛聚集在基因上游区域；CpG岛甲基化的增加与下有基因减少表达有关。DNA甲基化异常一直被假设为癌症的发病机制。和正常细胞相比，尽管癌症细胞趋向于高度去甲基化，但肿瘤抑癌基因启动子区CpG岛高度甲基化在许多肿瘤中是很常见的。

利用微阵列对急性髓系白血病样本进行全序列甲基化分析证实了样本亚群也有相同的甲基化模式。我们称从未化疗或放疗过且没得过骨髓增生异常综合征或骨髓增生性肿瘤的初患急性髓系白血病的患者为新增疾病的患者，与这些患者相比，患有骨髓增生异常综合征的病人样本会有异常的高度甲基化。尽管DNA甲基转移酶抑制剂的反应率低，个别病人的反应不可预测，且抑制剂与甲基化状态的关系不明确，它还是被广泛的用于治疗急性髓系白血病患者和骨髓增生异常综合征患者。然而，在一项最近的研究中，一种目标为DNMT3A信使RNA的微型RNA在急性髓系白血病患者原始细胞中过高度表达，这提高了DNA甲基转移酶抑制剂地西他滨的临床应答。

通过全基因测序在DNMT3A基因上发现了一个移码突变后，我们进行了一项研究来证实，在AML样本中DNMT3A基因是否频发突变，以及DNMT3A突变是否意味着低生存率。

方法

我们之前已经描述了先证者的临床特征。在机构审查委员会批准了隐私协议且具有明确的全基因组测序隐私保护条例情况下，病人的直系血亲同意对病人的肿瘤和皮肤基因组进行测序。我们也记叙了之前用于测序的方法，确定突变是否频发的方法，表达分析的方法以及结果分析的方法。全基因组分析5-甲基胞嘧啶含量的方法以及DNA甲基化芯片（MeDIP-chip）分析的方法在补充文件里有说明，补充文件可在NEJM.org上和本文献一起取得。

结果

DNMT3A突变的确认

我们先前测序了一个样本的AML基因，此基因来自于病人933124的短单末端片段，产生了980亿个碱基对序列和91.2%的二倍体基因组。在这项研究中，我们获得了1164亿个复发肿瘤基因组的双末端片段碱基对，产生了99.6%的二倍体基因组。改进的双末端片段覆盖序列算法和改进的突变算法使得我们能够识别几种一级突变，我们在最早的测序中都没发现这些突变，包括DNMT3A的一个碱基对缺失所产生的突变。我们随后证实，这种突变也出现在用于演示用的原始AML样本的显性克隆中。这种缺失导致了氨基酸723位置上编码赖氨酸密码子的移码，这意味着新氨基酸的合成（即不是由未突变的DNMT3A编码的氨基酸位置在氨基酸723内外），紧跟着一个在翻译框内的，过早出现的终止密码子。

AML中的DNMT3A突变

我们用PCR和Sanger测序法测序了188个初患AML患者的DNMT3A和DNMT3L（DNMT3L和DNMT3A或者和DNMT3A的同系物DNMT3B组成异二聚体）外显子，这些都来自于华盛顿大学样本库。这188个肿瘤患者都匹配了正常DNA样本以便分析。我们从白血病B组取得了另外的94个白血病样本，匹配不是从这些样本中取得的正常组织。这282个患者的数据、他们的治疗方法和突变类型都记录在补充文件中。尽管这些患者没有统一治疗，在他们当中最常见的AML突变是有典型性的，并且出来的临床结果同最近记录的其他类型病人的结果类似。

我们扩大测序了这282个肿瘤样本中的281个患者DNMT3A的全部24个外显子。在这些样本中，62个（22.1%）的突变被预测对转化有影响，这62个样本中有5个具有两个相互独立的突变，这些突变不跟预测的一样会影响氨基酸882位点。我们确定来自华盛顿大学的肿瘤样本的所有突变是体细胞突变，与其相匹配的皮肤样本中DNA序列缺失；表格1总结了所有被证实的体细胞突变。我们在白血病B组样本中的DNMT3A上发现了7个异常序列改变，但是没有和未受感染组织的DNA匹配，我们不能确定它们是否是体细胞变化。在白血病B组中发现的异常变化没有一个是之前就被证实的单核苷酸多态性。我们从所有的肿瘤样本组中发现了18个不同的无义突变。据预测，最常见的无义突变会影响氨基酸R882（样本为37个肿瘤病人），其中27个样本为R882H变化，7个为R882C变化，2个为R882P变化，1个为R882S变化。我们在DNMT3A和八个其他的基因上也发现了6个移码突变，6个无义突变和3个剪接突变和1.5Mbp的片段缺失。我们在受试的188个样本的DNMT3L外显子编码区并未发现体细胞突变。

AML基因组中DNMT3A突变和其他常见突变的关系可见于表1和图2。FLT3,NPM1和IDH1突变聚集在具有DNMT3A突变的样本中。79个AML样本中未发现DNMT3A突变（也不具有NPM1或者IDH1/2突变）且他们的细胞核型有一个有利的结果。（Plt;0.001）。同样的，11个混合谱系白血病基因处伴11q23染色体产生了结构变化的病人存在DNMT3A突变。根据法、美、英分型系统，166样本中DNMT3A突变的发生明显聚集在有中度风险的53个细胞表型样本中（33.7%，Plt;0.001），包括120个病人中有正常细胞表型的44个样本（36.7%，Plt;0.001），以及61个样本中有20个M4亚型（32.8%，Plt;0.001）,21个样本中有12个M5亚型（57.1%，Plt;0.001）。R882突变的病人白细胞数明显多于其他病人。有FAB M3形态亚型和DNMT3A突变的病人在记录后的2.2个月后死亡了，这个病人有正常的细胞表现型，却没有表现出任何AML t(15;17)染色体的任何特征。

我们获得的表达数据来自于华盛顿大学的180个样本中的180个样本（Affymetrix基因芯片人类基因组U133加2.0数据组）。我们从这些数据中发现了AML样本和正常造血细胞中编码DNA甲基转移酶基因的表达。DNMT3A基因在180个AML样本和正常人骨髓CD34 细胞中都能表达。它的表达随着终端髓系分化而减少。我们发现DNMT3A的表达在有DNMT3A突变的AML患者和没有DNMT3A突变的AML患者中是没有区别的。同样的，DNMT3B和DNMT1在AML样本和正常CD34 细胞中都具有高表达。对表达式数组设置单一DNMT3L探针显示没有任何样本中有DNMT3L表达，然而，从几个病人的AML细胞中检测到了剪接DNMT3L转录序列。为了确定突变DNMT3A基因的等位基因是否表达，我们从21个原发骨髓肿瘤样本中扩增了目标区域，并使用反转录PCR技术，用罗氏454高通量测序技术对扩增序列进行了深度计数。（表3和图4见补充文件）。对于大多数样本，互补DNA（cDNA）序列读取，包括突变等位基因数据读取的比例都是50%，这表明突变型和野生型等位基因的表达水平相近。cDNA样本中没有检测到一个无义突变（E77*）和一个移码突变（M315fs），表明mRNAs所携带的突变基因随着无义突变而减少。没有任何证据表明纯合子中DNMT3A基因表达的缺失是由于这五个样本所携带的两种突变。尽管我们在这个样本中能很容易从野生型等位基因上检测到cDNA，但是在样本编号246634上并没有检测到带有错义突变等位基因（A741V）或无义突变等位基因（E477*）的突变cDNAs。（见表3）。我们假设A741V和E477*在同一等位基因上，由此，它们同等的受无义突变介导的影响而减少。

突变模式

我们最近测序了38个细胞遗传学正常且初患AML样本的基因组，平均获得了每个癌症和其相匹配皮肤基因的25倍多得基因覆盖率。在这些基因中，11个存在DNMT3A突变，但不存在DNMT3L，DNMT1或者DNMT3B突变（数据未显示）。我们对每种基因的体细胞单核苷酸突变具有充足的信心，而且我们确定了这些突变的总数没有明显受到DNMT3A突变数的影响。（可见于补充文件图5）。此外，在每种基因上检测到的突变类型（Cgt;T,Cgt;G,Cgt;A等）也与DNMT3A突变数无关。（可见于表4 和图6）。

DNA甲基化

为了确定AML基因中5-甲基胞嘧啶的含量是否随着DNMT3A突变而改变，我们将来自于AML患者的骨髓基因组DNA水解为了核苷和磷酸，并运用液相色谱串联质谱仪对5-甲基-2rsquo;-脱氧胞苷-5rsquo;-单磷酸进行了化验。5-甲基胞嘧啶的含量在每个基因组中的平均含量（plusmn;标准差）在AML基因组中DNMT3突变与DNMT3A未突变时是一样的（野生型，4.89plusmn;0.57%；任意DNMT3A突变，4.77plusmn;0.50%; P=0.45)。（见于表5和图7）

运用DNA甲基芯片化技术分析，我们分别确定了五个具有R882H突变的AML基因组的甲基化模型和五个相匹配但无DNMT3A突变的AML基因组的甲基化模型（举例，具有相同的FAB亚型和原粒细胞比例）。在这10个样本中，几乎所有的甲基化区域都是相类似的（见于图8A），只有很小一部分例外（表6和图8B及图9）。与DNMT3A突变状态相关的共182个基因组区域的甲基化水平明显不同（相对于一个具体的基因位点）。在突变基因组中，这182基因区域在突变基因处的甲基化平均水平明显降低。在不同的甲基化区域，最邻近基因的异常表达没有一致的相关性。

基因表达和DNMT3A突变

我们用华盛顿大学样本库中188个样本中的180的样本的表达数据进行了无监督聚类分析。（见于图10）。虽然多个表达集群已经被弄清楚了，但是DNMT3A突变状态却一个也没弄清。相同的结果来自于有利细胞核型的76个AML样本亚群（见图11）。

临床结果和DNMT3A突变

我们通过281个DNMT3A突变状况已知的AML病人确定了无事件生存率和总存活率。这两个度量值非常相似，因此只有总存活率被报道了。DNMT3A突变的患者生存情况明显较差（图3A）。DNMT3A突变的出现与有利细胞核型（P=0.007）（见于图3B）和中度风险细胞核型（P=0.006）（见于图12）病人的低存活率也有关系。当病人存在根据DNMT3A状况而分类的FLT3内部串联重复突变时，那些携带DNMT3A突变的患者就有一个明显的不良结果（Plt;0.001）（见于图3C）。最后，DNMT3A突变的患者无论年龄是多少都不会有好的预后（年龄在60岁以下包含60岁，Plt;0.001；年龄在60岁以上，P=0.03），尤其年龄在60岁以上的DNMT3A突变患者的预后状况十分糟糕（见于图3D）。同时具有NPM1，IDH1/2和FLT3突变的AML患者的DNMT3A突变数据和他们的总存活率见于补充文件的图13,14和15。Cox比例风险模型表明总存活率的独立变化因素包括DNMT3A突变，FLT3突变和年龄。

讨论

DNMT3A在AML患者中频发，且与低无时间存活率、总存活率有关系。排除突变

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