胰岛素受体底物2在肾脏上皮细胞中表达并且在糖尿病性肾病中是正调节的外文翻译资料

 2022-10-17 15:59:24

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胰岛素受体底物2在肾脏上皮细胞中表达并且在糖尿病性肾病中是正调节的

关键词：骨成型蛋白质；糖尿病；胰岛素受体底物；肾脏；肾病

糖尿病性肾病是一种先进的纤维变性的情况，它可能导致晚期肾病和肾衰竭。在肾脏中转变生长因子-beta;1和骨成型蛋白质-7已经表明会引起糖尿病性肾病样变化并且各自保护肾脏不受这些变化的伤害。最新的数据认定肾单位水平的胰岛素作用在糖尿病性肾病的发展和前进过程中作为一种决定性的因素。胰岛素需要胰岛素受体底物蛋白家族来进行它的生理学效应，而且许多报告已经强调了胰岛素和胰岛素受体底物蛋白在肾脏生理学和疾病中的作用。

在这次的实验中，我们观察到胰岛素受体底物2更显著地表达于老鼠和人的发展中的和成年人的肾脏上皮细胞。人的肾脏邻近的肾小管上皮细胞的骨成型蛋白质-7疗法增加了胰岛素受体底物2的转录。另外，肾脏邻近的肾小管上皮细胞的骨成型蛋白质-7疗法在IRS－3的SDS／PAGE迁移实验中引起了一个电泳迁移，并且增强了和磷脂酰肌醇-3-激酶的联合，可能是因为增加的酪氨酸/丝氨酸磷酸化。在一群有一系列不同程度慢性肾脏疾病的病人身上，胰岛素受体底物2的mRNA水平大约被提高了9倍，在糖尿病性肾病病人的肾小管上，大多数的胰岛素受体底物2着色明显。这些数据表明胰岛素受体底物2在肾脏上皮组织表达并且可能在肾脏中由骨成型蛋白质-7引起的下游的防护事件中起作用。糖尿病性肾病病人的肾小管内的胰岛素受体底物2特别的上调也表明了胰岛素受体底物2的一种新奇的作用：作为人类糖尿病性肾病发展的一种标记和/或中介者。

简介

糖尿病是一种以胰腺的beta;细胞无法产生胰岛素和肌肉、肝脏和脂肪水平上的胰岛素抵抗为特征的代谢失调。糖尿病以心脏、脑和下肢的大的血管的以及肾脏和眼睛的较小的血管的血管并发症为特征。在世界各地糖尿病性肾病或肾病综合症是晚期肾功能衰竭的首要原因，并且在工薪族人群中糖尿病的视网膜病变是失明的首要原因。目前对于糖尿病性肾病的治疗只能延迟但不能阻止疾病的恶化。 最近的研究表明糖尿病性肾病中胰岛素信号传导的作用直接影响损伤的肾脏细胞。

新陈代谢和其它组织中胰岛素的作用需要胰岛素受体底物蛋白质的胰岛素受体酪氨酸激酶磷酸化来引起例如葡萄糖摄取、细胞增值和细胞长寿等关键的细胞效应。胰岛素受体底物蛋白质充当分子支架，为位于它们的C末端的YMXM, YVNI 或 YIDL图案作为锚定位点提供超过20种磷酸酪氨酸残留物给下游的例如 磷脂酰肌醇-3-激酶的p85/55/50亚基、 Grb2 和SHP2等效应物。这个机制促进Akt的激活的调解，细胞外的信号管理激酶和通过胰岛素雷帕霉素信号传输法的哺乳类动物的目标（另外其他的生长因子例如胰岛素样生长因子1和脑源性神经营养因子）以一种胰岛素受体底物蛋白质发展方式。胰岛素受体底物蛋白质也有许多的丝氨酸和苏安酸残留物，有许多磷酸化位点，例如 Ser307,通过例如junN-末端激酶1等，蛋白激酶C亚型和哺乳类动物的雷帕霉素的目标出现来禁止胰岛素受体底物蛋白质的功能，在细胞文化模型中促进胰岛素抵抗。和这些基础单元实验的结果形成对比，一个最近的论文表明 Ser307是一个胰岛素抵抗时维持胰岛素信号传导的正调节位点。

人类体内主要有3种胰岛素受体底物蛋白质：胰岛素受体底物1、胰岛素受体底物2和胰岛素受体底物4.胰岛素受体底物1和胰岛素受体底物2在大多数的组织中广泛地表达，但是胰岛素受体底物4的表达受制于下丘脑/垂体腺和胸腺。尽管这些蛋白质在整体结构和序列上很相似，在活的有机体内对个别的胰岛素受体底物蛋白质有独特的生理学作用。比如，老鼠缺乏的胰岛素受体底物1显示了减小的身体尺寸以及轻微的胰岛素抵抗，然而胰岛素受体底物2-/-老鼠是正常大小的但是重症糖尿病患者是因为胰腺的beta;细胞失效并且肝的胰岛素抵抗。研究已经强调了肝脏中胰岛素受体底物蛋白质的作用，Irs2-/-老鼠显示改变了的胰岛素刺激碳酸氢盐再吸收并且同样减少肾脏大小以及改变蛋白激酶B →糖原合成酶激酶3 beta;信号理论。在肾小球的水平,足状突细胞的胰岛素信号对于肾功能正常的是至关重要的，和老鼠拥有缺乏胰岛素受体的肾小球足细胞的老鼠发展蛋白尿和肾小球硬化症没有高血糖症。Mima等人发现在老鼠的肾小球和肾小管中胰岛素信号通路是通过胰岛素受体底物1和蛋白激酶c-beta;的，但是观察到诱发型糖尿病仅仅在血管小球的间隔区的胰岛素信号传导中存在缺陷。在一个32科目的小研究中，胰岛素受体底物1中一个Gly972→ Arg多态性与肾功能衰退有联系，可能是由于受损的胰岛素信号。这些和其他数据表明,胰岛素受体与胰岛素受体底物蛋白质的结合是肾脏生理学和糖尿病肾病的一个关键组成部分。

除了胰岛素,生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)与正常肾小球滤过屏障的发展有关联，在糖尿病肾脏和眼睛中对血管有保护作用。过度的VEGF（血管内皮生长因子）表达引起了一个引人注目的损失肾小球屏障的完整性,与肾功能下降有关。许多因素,如胰岛素和VEGF似乎在糖尿病肾病的肾脏足细胞的水平上调解他们的保护作用。骨成型蛋白质-7也被确认为肾脏功能的“保护者”,和在DN和其他肾纤维化模型中调节肾脏修复。骨形成肽生成蛋白7也在肾的发展中扮演了重要的角色,即从足细胞生产骨形成肽生成蛋白7对于正常的肾元发展是至关重要的。在肾脏足细胞和其他肾细胞中骨成型蛋白质-7从事规范的Smad蛋白1/5/8信号传导来调解它的细胞效应，以及细胞外的信号调节激酶在结肠癌细胞信号传导。

在这里,我们报告胰岛素受体底物2在发展中的和成人肾小管上皮的隔间表达。我们证明了骨成型蛋白质-7和胰岛素受体底物2启动子激活之间的联系和在肾小管上皮细胞中的信号传导。最后，我们表明,糖尿病肾病患者的肾小管中胰岛素受体底物2 mRNA的水平显著上调。这些数据对糖尿病肾病中胰岛素受体底物2的作用做了新的阐述,并确定了在肾小管细胞中骨成型蛋白质-7的一种新颖的非规范的信号通路。

结果

我们实验室以前的数据显示,胰岛素受体底物2信使RNA存在于鼠科动物肾脏在代谢水平高于肝脏等组织。相比之下,在老鼠的肝脏和肾脏胰中岛素受体底物1信使RNA水平是相似的,但在Irs-/-肾脏提取物中小幅上调(数据未显示)。胰岛素受体底物2也在早期E14.5的老鼠的肾皮质中被检测到,而胰岛素受体底物4的表达主要在脑垂体和胸腺被检测到(图1A)。在老鼠胚胎早期发育阶段胰岛素受体底物1的表达式没有发现。成人肾小管胰岛素受体底物2中等阳性,而肾小球细胞没有染色。相比之下,管状和肾小球隔间显示胰岛素受体底物1适度染色。这些数据显示在成年哺乳动物发展和肾脏中胰岛素受体底物基因表达的独特模式,并演示了在E14.5鼠肾皮质胰岛素受体底物2的表达。

在小鼠肾脏提取物中胰岛素受体底物2蛋白的检测很难使用现有的抗体,并且需要的免疫沉淀反应为胰岛素受体底物2丰富。在离散老鼠肾脏区域或细胞类型中使用现有的的抗体的免疫组织化学不能确定具体胰岛素受体底物2染色(数据没有显示)。为了识别胰岛素受体底物2是否表达于不同的肾元段,老鼠肾脏被微切成不连续的区段，如肾小球、近端小管、亨利循环和远端小管。这些区域提取的蛋白质免疫印迹显示胰岛素受体底物2主要表达在远曲螺旋小管和皮质集合管,染色较弱出现在近曲螺旋小管和皮层连接小管(图1 b,C)。连同数据显示胰岛素受体底物2表达在人类肾小管上皮细胞系,这些数据表明,胰岛素受体底物2主要表达在肾小管上皮细胞。
胰岛素受体底物2的删除造成了小鼠肾脏大小和重量将近20%的减少,可能是由于减少的近端小管卷。骨成型蛋白质-7的特殊型足状突细胞缺失也导致小鼠由于近端小管数量减少肾脏发育不全。因此,我们探讨是否骨成型蛋白质-7和胰岛素受体底物2信号传导与肾脏上皮细胞。用骨成型蛋白质-7治疗HK-2细胞诱导了胰岛素受体底物2 信使RNA在24小时内一个大约 2.5倍增加。为了进一步探索这种效果,我们检查是否胰岛素受体底物2启动子的特定区域参与这骨成型蛋白质-7调解激活。HK-2细胞转染有人类胰岛素受体底物2启动子的四个构造编码的各个部分(图2 B)。与看得见的内生的胰岛素受体底物2 信使RNA效应类似,胰岛素受体底物2 信使RNA感应的适度激活在骨成型蛋白质-7治疗的细胞中已经检测到被认为已经得到控制(图2 c)。这些数据表明,在肾脏上皮细胞胰岛素受体底物2 信使RNA水平调解的骨成型蛋白质-7 规则是适当的的并且可能涉及近端启动子元素。

生物信息学分析确定了在人类体内一系列的守恒Smad4转录因子位点,老鼠和老鼠Irs2基因组序列。在Irs2基因转录启动子位点近端区域的两个正向和反向链( / -1500bp)包含保守的转录因子模块与预测Smad4(GCTCagac)结合位点(图3)。
有趣的是,鉴于我们之前的数据显示,胰岛素受体底物2也可以调节转化生长因子beta;1(TGFb1)信号传导,保守的蛋白3位点也被在人类体内发现,老鼠和老鼠Irs2(数据没有显示)。这些数据支持的模块，即骨成型蛋白质-7信号传导通过规范化蛋白信号传导通路直接在HK-2细胞信号中调节Irs2转录。

胰岛素受体底物蛋白质如胰岛素受体底物2被充分地磷酸化在一系列丝氨酸、酪氨酸残基来与如胰岛素、肿瘤坏死因子alpha;和脑源性神经营养因子等配体反应。这些磷酸化事件导致发展缓慢的胰岛素受体底物蛋白质在SDS /PAGE电泳中迁移,并且在给下游的效应中胰岛素受体底物２调解的信号转导中扮演着一个关键角色。因此,我们检查在HK-2细胞骨成型蛋白质-7是否触发胰岛素受体底物2磷酸化。骨成型蛋白质-7没有大大地改变在HK-2细胞中胰岛素受体底物2的整体蛋白质水平， 但在24小时曝光后的确产生了向上的流动转变(图4A)。这种效应也观察到随着骨成型蛋白质-7浓度增加,每200 ng／ｍＬ骨成型蛋白质-7在胰岛素受体底物2 诱导类似向上的转移和10 ng/mL TGFb1(图4 B)。磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹法表明骨成型蛋白质-7导致在HK-2 细胞中胰岛素受体底物2的酪氨酸磷酸化的增加(图4 c)。在用成型蛋白质-7治疗海拉细胞时这种在胰岛素受体底物2流动性的效应也发生(图S1)。重要的是,最强的程度的诱发型成型蛋白质-7胰岛素受体底物2 酪氨酸磷酸化也与同时发生，在HK-2和海拉细胞Smad1/5/8磷酸化的正值高峰(图4 c)。用骨成型蛋白质-7治疗HK-2细胞也增加了胰岛素受体底物2 和磷脂酰肌醇3激酶p85调整的二级单位的联系,涉及磷酸酪氨酸残留物在胰岛素受体底物2 参加p85 的SH2区域(图.4D)。受刺激的骨成型蛋白质-7磷酸酪氨酸水平与p85 /p55绑定,这与这些在HK-2细胞内用胰岛素治疗看到的很相似，(图4D)。这些数据首次表明胰岛素受体底物2信号是被HK-2细胞的曝光增加给骨成型蛋白质-7。

先前的研究发现在胰岛素受体底物2中的单核苷酸多态性，没有与糖尿病有很的的隔离。为了扩展我们的分析,在糖尿病肾病中总体胰岛素受体底物2信使RNA水平上的变化被在一小群糖尿病肾病患者的标记的蛋白尿检查到,达到肾病范围的有五个病人(总尿蛋白排泄率gt; 3.5克/ 24小时,表1)。预计的肾小球滤过率的计算表明,所有患者都有3阶段慢性肾病或更者糟,一个病人(DN6)有第五阶段慢性肾脏疾病(表1)。胰岛素受体底物信使RNA水平很难得以控制，非糖尿病肾病(表1).I增长的胰岛素受体底物2的水平明显从糖尿病肾病患者的肾活检看到,并且肾小管的染色明显(图5 c,D和表1)。与控制相比，胰岛素受体底物2 信使RNA 的近似9.7倍的增加在糖尿病肾病患者中检测到,第一次展示出,增加了的胰岛素受体底物2的基因表达是一个糖尿病肾脏疾病的特征。有局灶性节段性肾小球硬化症或膜状肾病变的非糖尿病肾小球疾病患者的活体检查中并没有检测到明显的变化(图5),这表明在糖尿病的肾脏中高血糖症是胰岛素受体底物2信使RNA上调的主要动力。

讨论

在这里,我们表明,胰岛素受体底物2在肾脏上皮细胞中表达,并由骨成型蛋白质-7在转录水平通过假定的Smad4转录因子结合位点控制。胰岛素受体底物2发生酪氨酸磷酸化从而与骨成型蛋白质-7 反应,在糖尿病肾病(DN)患者的肾小管上皮细胞上调,把胰岛素受体底物2确定为人类身上糖尿病肾病一种潜在的新奇的的标志。总结这些数据如图5所示。

IRS2信使RNA在E14.5老鼠的发展中的后肾的皮质中被检测到(图1A)。适度的胰岛素受体底物2染色的其他区域中在这个时间点包括皮肤,原始的胸腺和背根的原始神经节。在 E14.5老鼠中胰岛素受体底物４的表达模式(在甲状腺和垂体有强大的染色,在中脑和丘脑下部有温和的染色;图1A和数据未显示)表明,这些胰岛素受体底物蛋白质的独特的作用在发展过程中存在于不同的细胞类型和组织。以前的工作确定：在成年小鼠肝脏和肌肉，以及beta;细胞和脑中胰岛素受体底物2和胰岛素受体底物4的表达的差异。在成长中的和成年小鼠组织中胰岛素受体底物2和胰岛素受体底物4的不

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