猪肝可溶性蛋白、膜蛋白分离与水解研究外文翻译资料

 2022-10-17 18:45:33

Inhibition of D4 Dopamine Receptors on Insulin Receptor Expression and Effect in Renal Proximal Tubule Cells

Abstract

Background Ion transport in the renal proximal tubule (RPT), which is increased in essential hypertension, is regulated by numerous hormones and humoral factors, including insulin and dopamine. Activation of dopamine receptor inhibits sodium reabsorption, whereas activation of insulin receptor increases sodium reabsorption in RPTs, and hyperinsulinemic animals and patients have defective renal dopaminergic system. We presume that there is an inhibition of D4 receptor on insulin receptor expression and effect, and the regulation is lost in spontaneously hypertensive rats (SHRs).

Methods and Results Insulin receptor expression was determined by immunoblotting, and Na ‐K ‐ATPase activity was detected in both Wistar‐Kyoto (WKY) and SHR RPT cells. Stimulation of D4 receptor with PD168077 decreased expression of insulin receptors, which was blocked in the presence of the calcium‐channel blocker, nicardipine (10minus;6 mol/L per 24 hours), in cell culture medium without calcium or in the presence of inositol 1,4,5‐trisphosphate (IP3) receptor blocker (2‐aminoethyl diphenylborinate [2‐ADB]; 10minus;6 mol/L per 24 hours), indicating that extracellular calcium entry and calcium release from the endoplasmic reticulum were involved in the signal pathway. Stimulation of the insulin receptor stimulated Na ‐K ‐ATPase activity, whereas pretreatment with PD168077 for 24 hours decreased the inhibitory effects of insulin receptor on Na ‐K ‐ATPase activity in WKY cells. However, in SHR cells, inhibition of D4receptor on insulin receptor expression and effect were lost.

Conclusions Activation of D4 receptor inhibits insulin receptor expression in RPT cells from WKY rats. The aberrant inhibition of D4 receptor on insulin receptor expression and effect might be involved in the pathogenesis of essential hypertension.

Key Words: dopamine receptor、hypertension、insulin、renal proximal tubule cells

Introduction

Essential hypertension affects 25% of the adult population.1 Ion transport in the renal proximal tubule (RPT) is increased in essential hypertension, which is regulated by numerous hormones and humoral factors, including insulin and dopamine.2, 3 Activation of dopamine receptor inhibits sodium reabsorption, whereas activation of insulin receptor increases sodium reabsorption in RPTs.3, 4Insulin has various effects. Besides its action on glucose metabolism, insulin affects blood pressure by regulation of vascular smooth muscle cellular proliferation, as well as renal salt and water excretion.4, 5, 6, 7 Diabetes mellitus is associated with sodium and water retention.8 There are evidences indicating that insulin, through stimulation of Na /H exchange and Na ‐K ‐ATPase activities directly, increases volume absorption in renal proximal tubules.6Dopamine is an endogenous catecholamine that modulates many cellular activities, including blood pressure and transmembrane ion transport.3 Dopamine receptors are classified into the D1‐like and D2‐like subtypes based on their structure and pharmacology. D1‐like receptors, comprised of D1 and D5 receptors, stimulate adenylyl cyclase activity, whereas D2‐like receptors, comprised of D2, D3, and D4 receptors, inhibit adenylyl cyclase activity, and regulate/modulate activity of several ion channels.3 Activation of D1‐like or D2‐like receptor induces natriuresis and diuresis.9

Increasing pieces of evidence show interactions between insulin and dopamine receptors.10, 11, 在肾近端小管细胞的多巴胺D4受体对胰岛素受体表达和作用的抑制

背景：当原发性高血压发生时肾近端小管(RPT)处的离子运输过程加强,它与许多激素和体液因子相关,这些相关因素包括胰岛素和多巴胺。多巴胺受体的激活抑制钠的重吸收,而胰岛素受体的激活促进了RPT处钠的重吸收,另外，患有高血糖的动物和病人都有一个缺陷性的肾多巴胺功能系统。我们假设D4受体对胰岛素受体表达和作用有一种抑制作用,而这种作用在自发性高血压大鼠(SHRs)体内消失。

结论：活化的D4受体抑制了WKY大鼠的RPT细胞中胰岛素受体的表达。D4受体对胰岛素受体表达和作用的异常抑制可能与原发性高血压的发病机制有关。

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关键词: 多巴胺受体、高血压、胰岛素、肾近端小管细胞

介绍

原发性高血压影响到成年人口的25%。当原发性高血压发生时肾近端小管(RPT)处的离子运输过程加强,它与许多激素和体液调节因子相关,这些相关因素包括胰岛素和多巴胺。活化的多巴胺受体会抑制钠离子重吸收,而活化的胰岛素受体会促进RPT细胞钠离子重吸收。胰岛素有许多不同的作用。它不仅对葡萄糖代谢有调节作用,而且通过调节血管平滑肌细胞增殖来影响血压,以及肾盐和水的透析。糖尿病与钠和水的滞留相关。有证据表明胰岛素是通过直接刺激Na / H 交换和Na -K -ATP酶活性来增加肾近端小管单位体积的吸收。多巴胺是一种内源性儿茶酚胺,它可以调节许多细胞活动,包括血压和跨膜离子运输。根据他们的结构和药理学将多巴胺受体分为D1类和D2类亚型。D1类受体包含D1和D5受体，可以激活腺苷酸环化酶，而D2类受体包括D2、D3和D4受体，可以抑制腺苷酸环化酶的活性,并且调节几种离子通道的转运活性。活化的D1类和D2类受体导致尿钠排泄和利尿等。

越来越多的证据显示胰岛素和多巴胺受体之间具有相互作用。患有高血糖的动物和病人都有一个缺陷性的肾多巴胺功能系统;活化的多巴胺受体可以调节肥胖人群的胰岛素水平，改善用链脲霉素(STZ)诱导2型糖尿病的大鼠的胰岛素敏感性和肾功能。因为D4受体和胰岛素受体都存在于RPT细胞中，我们假设活化的D4受体能够抑制胰岛素受体的表达和作用，而这一功能在高血压状态下是异常的。为了检验上述假设,我们研究了在WKY大鼠和自发性高血压大鼠体内无限增殖的RPT细胞上D4和胰岛素受体的相互作用。这些RPT细胞与新获得的RPT细胞行为相似，至少对多巴胺受体和对G-蛋白刺激的反应类似。

方法

细胞培养和样品制备

无限增殖的RPT细胞：取自在37°C 95%空气/ 5%二氧化碳气氛下，在一个100毫米培养皿装着的含有转铁蛋白(5igrave;g /毫升)、胰岛素(5igrave;g /毫升)、表皮生长因子(10 ng / mL)、地塞米松(4igrave;g /毫升),和5% 边后卫的DMEM / F -12下培养了4 ~ 8周的WKY和SHR大鼠的近端小管的显微解剖的S1段。在本文中所有的动物都是根据国家实验室动物的护理和使用指导处理的。

细胞在不含有FBS之前添加的试剂的培养基上静置孵化2小时。细胞(80%融合)被提取出放入冰裂解液中，使用超声波破碎细胞，在冰上放置1小时，然后在16000 g下 离心30分钟。所有样品在使用前都是储存于minus;70°C。

免疫印迹

胰岛素受体抗体是多克隆兔抗人抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA)。山羊多克隆p-胰岛素Racirc;抗体(圣克鲁斯生物技术)被用作磷酸化的胰岛素受体抗体。RPT细胞在如前所述的指定的浓度和时间下用媒介物(dH2O)，D4受体激动剂 (PD168077; Tocris Cookson Ltd, Bristol, UK)，或ABT724 (2‐[(4‐pyridin‐2‐ylpiperazin‐1‐yl)methyl]‐1H‐benzimidazole trihydrochloride; Sigma‐Aldrich, St. Louis, MO) 或D4受体拮抗剂 (L‐745870 [Tocris] or L750667 [Sigma‐Aldrich]) 处理。反式标记用胰岛素受体抗体来探测(1:400)。转移到膜上的蛋白质的数量取决于aacute;-肌动蛋白的免疫印迹。

细胞内钙离子浓度的测量

在实验前24小时,细胞被收集并且转移到7.5cm2培养皿中 (Falcon, Franklin Lakes, NJ)。细胞用含有钙离子指示剂, Fura‐2AM (5 igrave;mol/L)的HEPES缓冲盐溶液培养。然后使用一个波长为340和380 nm的带通滤波器系统测定单个细胞细胞内钙离子([Ca2 ])的变化。[Ca2 ]浓度变化是通过使用一条校准曲线上相邻点之间的线性回归方程计算Fura-2荧光比率(F340 / F380)得到的，这条标准曲线是通过将 [Ca2 ]浓度在0到854 nmol / L之间至少分成7组并分别测定其F340 / F380得到的。Ca2 集中在如前所述测定的个别组内。

第二信使与D4受体对WKY细胞内胰岛素受体表达的调节作用有很大关系

为了确定第二信使与D4 受体对WKY细胞内胰岛素受体表达的调节作用的关系，本文使用几种抑制剂和活化剂来研究。如：蛋白激酶C (PKC) 抑制剂 (PKC inhibitor 19–31, 10minus;6 mol/L)、蛋白激酶A (PKA) 抑制剂 (PKA inhibitor 14–22, 10minus;6 mol/L)、PKC活化剂 (PMA, 10minus;7 mol/L)、PKA活化剂 (Sp‐cAMPs, 10minus;7 mol/L)、钙离子通道阻滞剂 (nicardipine, 10minus;6 mol/L)和钙离子通道活化剂(BAY‐K8644, 10minus;6 mol/L)。这些试剂在用PD168077处理前15分钟添加到细胞培养基内。

PKC抑制剂19-31，PMA，PKA活化剂，钙离子通道阻滞剂和钙离子通道活化剂均购买于Sigma‐Aldrich公司。PKA抑制剂14-22是从Calbiochem公司(达姆施塔特,德国)购买的。

胰岛素受体的实时聚合酶链反应检测系统

从WKY和SHR细胞提取的总共2-3ug的总RNA被用来合成cDNA，cDNA被用作受体和acirc;-肌动蛋白放大的模板(作为看家基因)。对于acirc;-肌动蛋白，正向引物是5′-GTGGGTATGGGTCAGAAGGA-3rsquo;而反向引物是5′-AGCGCGTAACCCTCATAGAT-3′(资源库加入号:NM031144)。对于胰岛素受体,正向引物是5′-TTCAGGAAGACCTTCGAGGATTACCTGCAC-3′而反向引物是5′-AGGCCAGAG ATGACAAGTGACTCCTTGTT-3′(资源库加入号:X57764)。扩增是在下列条件下进行：在95°C 下变性3分钟,然后在95°C 10秒和60°C 30秒条件下扩增35周期。每次运行结束时，都要运行一次从65°C到95°C的熔化曲线分析，以便检测引物二聚体或非特异性产物的形成。该反应设置了三组平行组。胰岛素受体信使RNA的表达和acirc;-肌动蛋白mRNA的表达相似。

核RNA

核RNA与D4受体信使RNA和它的控制密码子RNA不同，它是使用反向高效液相色谱法合成和纯化的25聚体磷硫酰修饰的寡脱氧核苷酸(D4受体核RNA序列为：5′-AAGG ACCUCAAUGAAUAUGAAGAUAdTdT-3rsquo;；密码子RNA序列为：5′-TGACGATAAGAACAA TAACdTdT-3′)。 细胞在6孔板上培养，直至有60%的细胞发生融合，且Opti-MEM培养基上50 nmol / L的核RNA或密码子RNA与6igrave;l转染液混合 (生命表达载体技术,卡尔斯巴德,CA) 然后孵化24小时，然后再转移到生长培养基上培养24小时。细胞被收集用作D4受体反转录聚合酶链反应来确定核RNA对诱导D4受体基因沉默的效果。

Na -K -ATP酶活性测定

Na -K -ATP酶活性取决于无机磷酸盐释放的速度和乌本苷的存在与否。按照指示的浓度和持续孵化的时间用媒介物(dH2O)和D4受体激动剂(PD168077)处理大鼠RPT细胞。为了准备用于Na -K -ATP酶活性测定的膜，收集在21 cm2塑料培养皿中培养的RPT细胞然后用离心机3000g离心10分钟。然后将细胞放置在冰上，加入2毫升裂解缓冲液进行裂解(1 mmol/L of NaHCO3, 2 mmol/L of CaCl2 and 5 mmol/L of MgCl2)。将细胞裂解液用离心机在3000 g下离心 2分钟以除去完整的细胞，组织碎片和细胞核。将得到的上层清液与等体积的1 mol/L的碘化钠溶液混合,然后将混合物于48000 g下离心25分钟。将沉淀(膜碎片)清洗2遍然后再用含有 1 mmol/L 的 EDTA ( pH 值为7.4) 的10 mmol/L 的 Tris溶液溶解悬浮。通过考马斯亮蓝检测法(Bio‐Rad Laboratories, Hercules, CA)测定蛋白质浓度并调整为1毫克/毫升。膜蛋白于minus;70°C储存待用。

为了测定Na -K -ATP酶活性，每100-igrave;L膜碎片溶液与一个800igrave;L反应混合液混合 (75 mmol/L 的氯化钠, 5 mmol/L 的氯化钾, 5 mmol/L of MgCl2, 6 mmol/L 的叠氮化钠, 1 mmol/L of Na4EGTA, 37.5 mmol/L of imidazole, 75 mmol/L of Tris HCl, and 30 mmol/L 的组氨酸；pH为 7.4)以及含有或不含有1 mmol/L的乌本苷(最后的体积= 1毫升)，然后于37°C水浴下预反应5分钟。该反应由加入Tris‐ATP (4 mmol/L)开始，然后在37°C下孵化15分钟后通过加入50 ul 5

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