CAMTA介导的拟南芥低温和病原菌感染时水杨酸免疫通路的基因调控外文翻译资料

 2022-12-30 11:26:24

CAMTA介导的拟南芥低温和病原菌感染时水杨酸免疫通路的基因调控

原文作者 Yong Sig Kim Chuanfu An, Sunchung Park, Sarah J. Gilmour, Ling Wang, Luciana Renna, Federica Brandizzi, Rebecca Grumet, and MichaelF. Thomashow

单位 MSU-DOE Plant Research Laboratory, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824 MSU Plant Resilience Institute, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824 Laboratory of Seed Science and Technology, State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, P.R. China Department of Horticulture, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824 ePlant, Soil, and Microbial Sciences, Michigan State University, East Lansing, Michigan 48824

摘要：拟南芥钙调素结合转录激活因子CAMTA抑制22°C下健康生长的植株中水杨酸SA生物合成相关基因及SA介导的免疫。这个抑制会被低温处理（4°C）或者活体和半活体营养病原菌侵染所解除。本文研究显示CAMTA3介导的SA通路基因的抑制涉及到N端抑制单元NRM的表现，NRM起作用独立于钙调素CaM结合到IQ和CaM结合（CaMB）结构域。该发现与现有的推论认为CAMTA3抑制活性需要CaM结合到CaMB结构域上相违背。响应于低温处理的SA通路基因诱发在只表达CAMTA3-NRM区域的植株中并未检测到。突变分析显示NRM的抑制活性会被响应于低温处理产生的信号的IQ和CaMB结构域所抑制。表达CAMTA3-NRM区域的植株在对病毒性半活体病原菌丁香假单胞菌DC3000的抗性上有所缺陷。本文的研究结果表明低温处理和病原菌侵染调控的CAMTA3抑制活性涉及到一些分子机制，但两者有明显区分。

关键词：CAMTA；CaM；NRM；SA途径

前言

图1 CAMTA3-GFP抑制camta2/3植物SA途径基因的表达。

（A）将CAMTA3p:CAMTA3-GFP结构转化为camta2/3突变株并对3个转基因株系C3、C5和C23进行了鉴定。植物在22℃，12小时的光周期下生长20天，并用RT-qPCR检测相关转录水平。免疫印迹分析采用抗GFP抗体检测CAMTA-3GFP蛋白，并用抗组蛋白H3抗体检测组蛋白H3作为内参照。用于RT-qPCR标准化的基因在方法中有指示，数据在方法中有详细说明。误差条表示SE（n=3个生物样本）。标有不同字母的条形图明显不同（LSD，Plt;0.05）。

（B）在与（A）相同的条件下生长的转基因系C3、C5和C23中测定PR1、ICS1、CBP60g和SARD1的转录水平。数据按方法中的方式进行方差分析。误差条表示SE（n=3个生物样本）。标有不同字母的条形图明显不同（LSD，Plt;0.05）。

（C）野生型、camta2/3和转基因植物在22℃的12小时光周期下生长32和49天后的照片。

钙调素（CaM）结合转录激活因子（CAMTA） (也称为信号响应[SR]蛋白)在植物和其他多细胞真核生物中具有广泛的保守性(Finkler et al., 2007)。它们可以调节，非生物胁迫耐受基因的表达,并对细菌病原体有防御作用(Shen et al., 2015)。根据是否存在TIG（转录相关免疫球蛋白）结构域（Rahman et al., 2016），六种CAMTA蛋白可分为两类，它们在非特异性DNA结合中起作用:而CAMTA4、CAMTA5和CAMTA6具有TIG域，CAMTA1、CAMTA2和CAMTA3则不具有。除此这种差异，每个拟南芥CAMTA蛋白有四个功能域，它们从N端到C端的相对顺序相同（Rahman et al., 2016）：CG-1 DNA结合结构域、ANK重复结构域、一个由两个IQ基序组成的IQ域，和一个CaM结合结构域。IQ和CaMB结构域,它们都以钙依赖的方式与CaM结合( Boucheacute; et al., 2002; Choi et al., 2005; Du et al., 2009; Nie et al., 2012)。

在温暖的环境（22℃）下生长的健康植物中，CAMTA1、CAMTA2和CAMTA3（也称为SR1）主要以相加效应抑制水杨酸（SA）免疫途径基因的表达（Du et al., 2009; Galon et al., 2008; Kim et al., 2013; Kidokoro et al., 2017）。这些基因包括异分支酸合酶（ICS1），它可以编码等位酸合酶，这是拟南芥SA生物合成的主要限速酶步骤(Dempsey et al., 2011; Wildermuth et al., 2001)；钙调素结合蛋白60-LIKE.g（CBP60g）和SARD1，它编码转录因子，与ICS1启动子结合并刺激其转录(Truman et al., 2013; Zhang et al., 2010)；还有EDS1和PAD4，它编码假定的脂肪酶样蛋白，通过一种不足的机制促进SA的积累(Feysetal.,2001;Venugopaletal.,2009)。在CAMTA3和camta1/2/3三重突变植株中，ICS1、CBP60g、SARD1、EDS1和PAD4的转录水平远高于野生型植物，导致高水平SA的生物合成和PR1及其他SA调节防御基因的生成(Du et al., 2009; Kim et al., 2013)。更广泛地说，超过1000个基因的转录水平在camta1/2/3突变体植物中比野生型植物中高，并且在GO terms “防御反应”、“固有免疫反应”和“对SA刺激的反应”中高度转录(Kim et al.,2013)。与CAMTA1、CAMTA2和CAMTA3一致，CAMTA1、CAMTA2和CAMTA3在抗逆境植物SA免疫防御途径的表达中起重要作用(Du et al., 2009; Galon et al., 2008; Kim et al., 2013; Kidokoro et al., 2017)。

CAMTA蛋白如何抑制非胁迫植物SA途径基因的表达？目前，虽然有证据表明它涉及CaMB和IQ两个结构域的作用，但人们对此知之甚少。Du et al(2009) 在CAMTA3-CaMB结构域中发现了一个突变，该突变破坏了CAMTA3与CaM的结合，并发现该变异蛋白在抑制ICS1、PR1和其他SA通路基因的表达方面存在缺陷。因此，研究人员得出结论，CAMTA3抑制基因表达的能力需要CaM与CaMB结构域结合。至于IQ结构域，Nie et al. (2012) 和Jing et al. (2011)将独立识别的突变，分别命名为sr1-4D和sard3，它们使植物更容易受到活体细菌和真菌病原体的感染。sr1-4D和sard3突变被证明是相同的，在CAMTA3的第一个IQ基序内引起氨基酸变化，导致功能表型的增加。特别是将sr1-4D突变引入到edr2中（edr2突变导致PR1的组成性高水平表达，增强了对白粉病的抗性。）导致PR1显著下降，大大降低了植物对白粉病病原菌侵染的抗性(Nie et al., 2012)。此外，sr1-4D突变体中ICS1、PAD4和EDS1的SA水平和转录水平低于野生型植株。sr1-4D和sard3-IQ突变使SA介导的免疫获得功能抑制的机制尚不清楚，但似乎不是由于CaM与IQ结构域的相互作用改变所致，因为CAMTA3和IQ突变蛋白均以钙依赖的方式与CaM结合(Nie et al., 2012)。

CAMTA蛋白抑制SA免疫途径基因的能力在活体和半活体营养病原体感染时被解除(Poovaiah et al.,2013;Fromm and Finkler, 2015)。一般认为，这种调节涉及CAMTA3与CaM相互作用的变化，这种变化是由已知的细胞内钙水平的波动引起的，而钙水平的波动是在病原体攻击时发生的(Reddy et al., 2011)。此外，Zhang et al. (2014)提供了CAMTA3因病原体攻击而降解的证据。研究表明，这种降解涉及SR1IP1的作用，一种蛋白质，被提议作为一种连接中枢，将CAMTA3组合到cullin3 E3连接酶上，导致CAMTA3泛素化并被26S蛋白酶体降解。

CAMTA蛋白对SA免疫途径的抑制作用在长期低温下也能被解除。Scott et al.（2004）第一份报告指出，拟南芥植物在低温（5°C）下的SA水平会升高，但直到植物暴露在这种温度下超过一周后才会升高。Kim et al.(2013)证实了这一结论，并表明携带ICS1的一个空等位基因sid2-1突变的冷处理植物中的SA水平没有增加(Wildermuth et al.,2001)，这表明在低温下SA的生物合成通过等位酸合酶途径进行。暴露在低温下一周以上的植物，我们发现SA通路基因的转录水平很高，这些基因包括ICS1、CBP60g、SARD1和PR1(Kim et al., 2013)。

本研究的主要目的是更好地了解CAMTA3是如何在健康的非胁迫植物中抑制SA通路基因的表达的，以及如何在低温下解除这种抑制。我们的结果使我们提出了一个模型，在这个模型中，CaM结合到CAMTA3 CaMB域的作用与目前的想法相反：在非胁迫植物中，CAMTA3抑制活性需要CaM结合CaMB结构域而不是CaM，我们认为需要降低CAMTA3的抑制活性，以响应压力所产生的信号。此外，我们的结果提供了证据，表明在低温和病原体感染下，CAMTA3抑制活性的调节涉及相关机制，但也存在显著差异。

结果

CAMTA3的N端起抑制模块的作用

作为了解CAMTA3如何在健康的非胁迫植物中抑制SA通路基因的表达，以及如何在低温下解除这种抑制的一个步骤，我们在已知或潜在的功能域中制备了具有修饰的CAMTA3-GFP变体，并确定这些蛋白是否能够在温暖（22°C）和寒冷（4°C）温度下抑制SA通路基因的表达。所有的CAMTA3-GFP变异蛋白都置于内源CAMTA3启动子的控制下，转化为camta2/3双突变体植株。我们选择将构建体转化为camta2/3突变体，与camta3单一突变株相反，因为在camta2/3突变体中SA生物合成和SA途径基因的表达比在camta3突变体中要强(Kim et al., 2013)。此外，我们选择了camta2/3突变体，而不是camta1/2/3三突变体，因为三突变体体积小，难以处理。

在我们最初的实验中，我们要求CAMTA3-GFP蛋白融合是起作用的。在三个转基因系中，CAMTA3-GFP转基因的转录水平在野生型植物中比内源CAMTA3基因的转录水平低50%（C23列）到大约多6倍（C5列）（图1A）。每一株系中的CAMTA3-GFP蛋白水平与转基因的转录水平一致（图1A）。如前所示（Kim et al.，2013），SA途径基因PR1、ICS1、CBP60g和SARD1的转录水平在camta2/3植物中比野生型植物高很多（图1B），并且camta2/3植物的大小比野生型植物小得多（图1C）。CAMTA3-GFP转基因表达抑制了SA途径基因的表达（图1B），并抑制了camta2/3植物的矮小表型（图1C）。这些结果表明GFP标记的CAMTA3蛋白具有活性。

接下来我们制作了六个CAMTA3-GFP蛋白变体（为了简单起见，以下称为CAMTA3变体）（图2A）：CAMTA3K907E、CAMTA3A855V、CAMTA3K907E/A855V、CAMTA3S454A/S964A、CAMTA3S454D/S964D和CAMTA3334。在我们的分析中，每种蛋白质变体都使用了两个株系，其中大多数在CAMTA3 C3转基因植株中以接近CAMTA3的转录水平（补充图1）和蛋白质水平（图3A）表达转基因（例外情况是株系SA22、KE2和KE28，其表达水平比CAMTA3 C3转基因系高4-6倍）。

根据Du et al. (2009)的研究结果表明CAMTA3抑制SA通路基因表达的能力需要CaM与CaMB结构域结合，我们猜测不包括CaMB结构域的CAMTA3334不能抑制SA通路基因的表达。相反，我们发现CAMTA3334在抑制PR1、ICS1、CBP60g和SARD1的表达方面非常有效（图2B）。此外，CAMTA3334抑制了camta2/3植物的SA生物合

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