辣椒第一类WRKY转录因子CaWRKY58基因在其应对青枯病菌的响应中起负调控作用外文翻译资料

 2022-12-30 11:26:59

辣椒第一类WRKY转录因子CaWRKY58基因在其应对青枯病菌的响应中起负调控作用

原文作者：

YUNA WANG 1,2, FENGFENG DANG 1, ZHIQIN LIU 1 , XU WANG 1 , THOMAS EULGEM 3 , YAN LAI 1 , LU YU 1 , JIANJU SHE 1 , YOULIANG SHI 1 , JINHUI LIN 1 , CHENGCONG CHEN 1 , DEYI GUAN 4 ,ALLIAN QIU1AND SHULIN HE1,4,*

作者单位：

1. College of Life Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

2. Department of Life Science, Luoyang Normal University, Luoyang, Henan 471022, China

3. Center for Plant Cell Biology, Institute for Integrative Genome Biology, Department of Botany and Plant Sciences, University of California at Riverside, Riverside, CA

92521, USA

4. National Education Minister Key Laboratory of Plant Genetic Improvement and Comprehensive Utilization, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

摘要：WRKY转录因子由整个植物界的大型基因家族编码。到目前为止，人们对包括辣椒在内的茄科非模型植物的生物学和分子功能仍然知之甚少。在这里，我们阐述了来自辣椒新第I类WRKY蛋白CaWRKY58的功能进行分析。我们的数据表明，CaWRKY58定位于细胞核，并且可以激活由35S核心启动子驱动的报告基因beta;-葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）的转录，在其近端上游区域有两个拷贝的W-盒（W-box）。在感染细菌性病原体青枯菌的辣椒植物中，CaWRKY58转录水平显示出双相反应，表现为早期短暂下调和后期上调。茉莉酮酸甲酯和脱落酸处理后会抑制CaWRKY58转录。过量表达CaWRKY58的烟草植物未显示任何明显的形态表型，但显示出比野生型植物严重的疾病症状。过度表达CaWRKY58的烟草植物的敏感性增加与超敏反应标记基因以及各种与防御相关的基因的表达降低有关。同样，被病毒诱导的基因沉默（VIGS）作用的CaWRKY58辣椒植物显示出对高毒力青枯菌FJC100301的抗性增强，这与辣椒防御基因的转录增强相关。我们的研究结果表明，CaWRKY58在辣椒对青枯菌感染的抗性中充当负调控作用的转录激活因子。

前言

植物经常受到多种微生物病原体的攻击。除了组成型防御，例如蜡质表皮或预先形成的抗菌化合物外，植物还会采用诱导型先天免疫，由两个相互连接的分支组成，称为病原体相关分子模式（PAMP）触发的免疫（PTI）。 PTI通过植物细胞表面模式识别受体（PRR）被PAMP或微生物相关分子模式（MAMP）激活，引起非宿主抗性。适应了的病原体将分泌抑制PTI的效应分子。作为对策，植物进化出抗性（R）蛋白，该蛋白识别效应子并以基因对基因的方式激活ETI。PTI和ETI通过各种调节成分相互连接，例如PRR和R蛋白，ADP核糖基化因子和鸟嘌呤核苷酸交换因子，并同时激活局部和全身防御反应。广泛的基因表达和代谢重编已与PTI和ETI相关联，并且似乎受复杂的信号网络控制。先前的研究表明，各种植物激素，活性氧中间体，促分裂原活化蛋白（MAP）激酶和转录因子（例如WRKY转录因子）在PTI和ETI中都有作用。ETI和PTI之间的转录反应差异似乎是定量的而不是定性的。与PTI期间观察到的相比，ETI期间免疫应答的激活更快，时间更长且更可靠。植物激素，尤其是水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）在PTI和ETI中起着至关重要的作用。依赖SA的植物防御通常是由生物营养性病原体引起的，而依赖JA的植物防御通常由死体营养性病原体和草食动物激活。这些防御激素之间的平衡取决于公认的病原体，并且SA和JA信号传导可以根据其浓度而产生拮抗或协同作用，从而对防御反应的范围进行微调。

WRKY蛋白是一类由大基因家族在所有植物中编码的含锌的转录因子，其特征是存在一个或两个含有60个氨基酸的WRKY结构域。在拟南芥和水稻的基因组中，分别发现了72个和109个WRKY蛋白成员。根据其主要结构，WRKY成员分为三类（I，II和III）和各种亚组（例如IIa，IIb等）。通常认为WRKY转录因子通过与W-box结合而成为主要的调节蛋白，W-box是其靶基因启动子中常见的顺式元件。已发现许多WRKY转录因子参与了对生物和非生物胁迫的防御反应的调控。在拟南芥中，WRKY58在NPR1下游起作用，NPR1是系统获得性抗性的负调节剂，而WRKY39被SA和JA信号通路正向调节，从而增强了耐热性。先前的研究表明，WRKY蛋白不仅参与ETI的调节，而且还参与PTI的调节，并且特定的WRKY蛋白可以在植物的基础防御反应中充当正或负调节剂。因此，WRKY蛋白似乎参与了植物防御的复杂信号转导和转录网络的严格调控。

辣椒在世界范围内都是重要的农作物，并且由于疫病（如疫霉疫和辣椒细菌枯萎）而成为对裁剪敏感的连续作物。青枯雷尔氏菌是毁灭性的土壤传播细菌，在包括胡椒和烟草在内的200多种对经济有重要意义的植物物种中引起枯萎病。了解植物抗青枯菌的遗传机制将极大地促进各种作物改良品种的开发。在转录调节水平上对调节过程的操纵似乎特别有研究意义，因为这将允许改变与特定性状相关的关键成分的表达特征，而对其他细胞过程的干扰达到最小。迄今为止，仅从辣椒中克隆了少量WRKY转录因子，并对其功能进行了定义，包括CaWRKYb，CaWRKY2，CaWRKY-alpha;和CaWRKY1，它们已显示出与防御相关的作用。在本研究中，我们报告了一种来自辣椒的WRKY蛋白，命名为CaWRKY58，可作为抗青枯菌免疫力的负调节剂。

结果

CaWRKY58的克隆和序列分析

通过搜索TBLASTN(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的表达序列标签，我们鉴定了与AtWRKY58转录因子相似的9个EST。发现其中一个在其推导的氨基酸序列中具有两个WRKY结构域，我们选择它来设计和合成引物。利用引物对，我们对由UVB处理的辣椒叶片的RNA构建了cDNA文库，并进行了聚合酶链反应（PCR）的筛选。我们发现分离出的阳性克隆长度为1493bp，包括41 bp的5非翻译区（UTR），1137bp开放阅读框（ORF）和315bp 3UTR。预测其ORF编码具有378个氨基酸残基的蛋白质，和两个含有60个氨基酸的WRKY结构域。我们预测蛋白质的相对分子量和理论pI分别为42.0 kDa和8.21。同源性搜索进一步证实了超家族保守结构域与已知的WRKY 转录因子的高度相似性，并暗示它代表了WRKY I亚组的成员。该WRKY序列与相关序列的比对分析表明，它与先前鉴定的胡椒WRKY基因（Q5DJV3）编码的蛋白质具有100％的氨基酸同一性。此外，我们发现它与AtWRKY3（Q9ZQ70），AtWRKY4（Q9XI90）和AtWRKY58共享46.0％，44.0％和51.0％的标识（Q93WU7）。由于AtWRKY58是最紧密相关的拟南芥WRKY蛋白，因此我们将其称为cDNA克隆CaWRKY58，与烟草（普通烟草）WRKY-7（Q94IB5）和葡萄WRKY2（ Q5IY47）同源（图1）。迄今为止，尚无可用的茄科植物CaWRKY58或任何相关转录因子的功能分析，因此我们继续对其进行定义。

CaWRKY58蛋白主要位于细胞核

基于WoLF PSORT的序列分析(http://wolfpsort.org/) 推测CaWRKY58蛋白含有三个假核定位信号（165PAKKKVE171、192PTKQRKD198和266PDAKRTK272；图1）。为了证实其核定位，我们总结了CaWRKY58绿色荧光蛋白（GFP）融合驱动的组成型CaMV35S启动子。用荧光显微镜观察了p35S::CaWRKY58-GFP基因和p35S::GFP基因（阴性对照；图2A）在烟草叶中的亚细胞位置。典型结果指数CaWRKY58-GFP在细胞核中的特异性定位，而GFP单独发生在多个亚细胞室中，包括细胞质和细胞核（图2B）。

CAWRKY58可以激活转录

许多研究已经证明WRKY蛋白与W-box的序列特异性结合，其通常用作防御相关基因启动子中的病原体应答调控

元件，包括SA反应性致病相关基因，以及许多WRKY基因。为了测试这是否也适用于CaWRKY58，我们用含有CaMV35S启动子（P35S::CaWRKY58）控制的全长CaWRKY58 cDNA和包含CaMV35S核心启动子(-46到 8 bp）控制的报告载体2times;W-p35core::GUS或没有P35core::GUS两个拷贝的W盒在其近端上游区域（图3A）。报告载体单独或与效应器构建物共同转化为洋葱表皮细胞，通过粒子轰击，然后用组织化学格斯法使得报告基因表达。洋葱表皮细胞与2times;W-p35core::GUS和效应质粒常染色深蓝色；在25%的视野中发现深蓝色细胞（图3B）。相反，用报告载体或与p35core::GUS和p35s::CaWRKY58从未染色蓝色。

CAWRKY58转录对青枯菌感染的应答

为了检测CaWRKY58是否参与免疫应答，CaWRKY58在叶片中的转录表达模式。用实时定量PCR（qPCR；图4A）测定辣椒C. annuum青枯病的致病因子R. solanacearum的感染。与模拟处理的对照植物相比，接种后3～12小时，CaWRKY58转录因子的毒性降低。R. solanacearum株FJC100301毒性强。这种下降是在3hpi检测到的，最低水平可观察到6hpi。CaWRKY58转录水平恢复到它们的基态在24hpi，并继续进一步增加，达到最高水平（1.6倍诱导）在48hpi。诱导CaPR1转录积累证实R. solanacearum感染成功。这些结果表明CaWRKY58在调节辣椒对R. solanacearum防御反应中的作用。

CaWRKY58对外源SA、茉莉酸甲酯（MeJa）、脱落酸（ABA）和乙烯（ET）的转录反应

植物激素，如SA、JA、ABA和ET，是植物防御生物和非生物胁迫反应的重要信号分子，在下游防御基因表达的调节中起着至关重要的作用。为了评估CaWRKY58在这些激素所利用的信号级联中是否参与，用qPCR测定了四个分别用SA、MeJA、ABA和ET处理的叶椒植物叶片的CaWRKY58转录水平。在5毫摩尔SA的作用下，CaWRKY58的转录水平在处理后1小时增加到12hpt，在6hpt达到最大水平（相对于模拟处理的对照植物的2.1倍；图4B）。24小时后，CaWRKY58转录水平下降。CaPR1 转录在SA应用后积累得很强。在100毫摩尔MeJA的作用下，CaWRKY58转录水平在1和48 hpt之间，而已知的JA应答基因CaPIN2的水平被强烈诱导（图4C）。在1和48hpt之间的ABA，CaWRKY58转录下降（图4D）。相比之下，已知的ABA应答CaDepro基因的转录在相同的时间间隔内强烈积累。10毫摩尔ET的应用增强了1至48 HPT之间的CaWRKY58转录水平，在3 HPT附近达到最大值（图4E）。同样，已知的ET应答CaACC氧化酶基因的转录被强烈诱导。

图1 CAWRKY58的氨基酸序列与代表性相关蛋白拟南芥WRKY4（Q9XI90）、AtWRKY3（Q9ZQ70）、AtWRKY58（Q93WU7）、普通烟草WRKY DNA结合蛋白（Q94Ib5）和葡萄DNA结合蛋白WRKY2（Q5IY47）的比较。绿色阴影，50% - 75%的身份；红色阴影，75% - 100%身份，黑色阴影，100%身份。由DNAMAN5进行。

图2 CaWRKY58的亚细胞定位。（a）P35S::GFP和p35S::CAWRKY58-GFP构建体的示意图。（b）CaWRKY58-GFP仅局限于Nicotiana benthamiana叶细胞核；绿色荧光蛋白（GFP）单独定位于整个细胞；4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）图像表明细胞核染色。荧光显微镜观察24小时后，进行农业渗滤。

图3 CaWRKY58反式激活实验用洋葱表皮细胞进行粒子轰击。（a）使用的报告和过表达结构的示意图基因转染的洋葱表皮细胞的共转染（b）

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