水稻Osmyb4基因的过量表达提高了拟南芥植物低温和冰冻的耐受性外文翻译资料

 2023-01-03 12:30:52

水稻Osmyb4基因的过量表达提高了拟南芥植物低温和冰冻的耐受性

Candida Vannini, Franca Locatelli,Marcella Bracale,Enrico Magnani, Milena Marsoni, Michela Osnato,Monica Mattana, Elena Baldoniand Immacolata Coraggio

Dipartimento di Biologia Strutturale e Funzionale, UniversitaAacute; dellInsubria, via J.H. Dunant 3, 21100 Varese, Italy, and

Istituto di Biologia e Biotecnologia Agraria, C.N.R., via E. Bassini 15, 20133, Milano, Italy

摘要

通过4℃强烈诱导并在29℃下生长3天的水稻（水稻）胚芽鞘中检测到基因Osmyb4低水平的表达。在亚致死温度10和15℃时，其在水稻幼苗中的表达已经很明显，但这种效应不能被其他胁迫或ABA处理所替代。 我们通过Myb4反式激活PAL2，ScD9 SAD和COR15a低温诱导型启动子的瞬时表达得到证明。在组成型CaMV 35S启动子的控制下，被证实在拟南芥植物（生态型Wassilewskija）体内Osmyb4基因的功能是过量表达它的cDNA。通过对其膜或光系统II（PSII）的稳定性和整株植株的耐受性的测量，Myb4基因过表达植株表现出显著增加了对低温和冰冻的耐受性。最后，在Osmyb4转基因植物中，不同冷诱导途径下的基因的参与表达受到影响，表明Myb4是耐寒性的主开关。

关键词：Myb转录因子，非生物胁迫，耐冷性，水稻，拟南芥，转基因植物。

引言

暴露于低温非冰点温度下的植物可通过一种称为适应的过程增加冷冻耐受性（Guy，1990;Levitt，1980）。这种冷诱导反应会引起基因表达，内膜组成，酶活性以及渗透物和冷冻保护剂如脯氨酸，糖和多胺的积聚的变化。植物冷调节基因（Seki等，2002; Thomashow，1998,1999）涉及碳水化合物、脂质、苯丙素和抗氧化剂的呼吸、代谢，分子伴侣和抗冻蛋白的产生，渗透保护剂和渗透剂。虽然几种冷调节基因也可以通过ABA诱导，但冷诱导的基因表达可能与激素无关。 例如，虽然COR78，COR47和COR6.6是由非生物胁迫和ABA诱导的，但aba和abi的突变对它们的冷诱导几乎没有影响（Gilmour和Thomashow，1991; Nordin等，1991）。

通过低温和脱水基因的诱导，识别含有CCGAC保守核心的C重复（CRT）/脱水元件（DRE）的DNA顺式调控序列（Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，1994）。随后确定了结合CRT / DRE的转录因子：它们由属于AP2 / EREBP类的两个小家族构成。CBF1，CBF2和CBF3（或分别为DREB1B，DREB1C和DREB1A）是低温诱导的，而DREB2A和DREB2B是干旱调节的（Gilmour等人，1998;Liu等人，1998;Shinwari等人，1998;Stockinger等人，1997）。CBF3 / DREB1A或CBF1 / DREB1B基因在拟南芥中的组成型过表达诱导COR基因的表达和糖和脯氨酸含量的增加（Gilmour等人，2000;Jaglo-Ottosen等人，1998;Kasuga等人，1999;Liu等人，1998）。虽然DREB1基因仅在冷胁迫下在体内被诱导，但其在转基因植物中的过表达也导致对干旱和盐胁迫的耐受性的提高（Kasuga等人，1999）。

CRT结合因子（CBF）途径是低温应答的中心成分，但其他途径也被植物中的低温胁迫激活。例如，eskimo 1基因定义了一个与CBF介导不同的低温适应信号通路。在非适应和低温适应的eskimo 1植株中，增加的冷冻耐受性是显而易见的，同时还具有更高水平的脯氨酸（30），可溶性糖（2）和RAB18转录物。然而，在eskimo 1植物中未观察到野生型中的COR转录物增加（Xin和Browse，1998）。因为拟南芥转录组中复杂的冷应答，所以微阵列分析也被用于跟踪其复杂的变化。Seki等人 （2002）已经确定了40个属于AP2 / EREB，锌指，ERF，WRKY，bZIP和MYB家族的转录因子，它们共同或分别调控应激诱导基因。Fowler和Thomashow（2002）为至少15种不参与CBF冷应答途径的冷调节转录因子的活性提供了直接证据。

在本文中，我们报道了水稻的涉及耐冷性的Myb基因Osmyb4（登录号Y11414）。我们证实它在4℃诱导下的水稻中表达，并且它能够瞬时反式激活低温诱导型启动子。Osmyb4在拟南芥转基因植物中的过表达增加了其低温和冰冻的耐受性，这些反应与属于不同低温诱导途径的基因的表达有关。

结果

Osmyb4的表达是在水稻中低温诱导的

水稻（栽培品种Arborio）的Osmyb4 cDNA从胚芽鞘cDNA文库中分离（Pandol等，1997）。为了表征Osmyb4表达模式，用Osmyb4特异性基因区域（Sma Iplusmn;Bgl II片段，图1a）作为探针，对经过几种条件处理的水稻胚芽中提取的mRNA进行Northern分析。在生长3天经过4℃4小时处理的水稻胚芽鞘中显著增加了Osmyb4 mRNA的含量。此外，盐，干旱，高温或缺氧以及ABA和IAA处理都不会影响Osmyb4的表达（图1b）。厌氧发芽的水稻不表达Osmyb4（图1b，泳道10d）。通过利用RT-PCR测定水稻在不同温度下（在15,10和48℃处理6小时）的表达情况，表明Osmyb4在低温应答中的作用。通过对几个品种的水稻的Osmyb4 mRNA量的分析，其含量随着胚芽鞘培养温度的降低而增加（数据未显示）。

图表 1 水稻中的Osmyb4的表达

  1. Osmyb4 c DNA：箭头，Osmyb4特异性寡核苷酸; Sma I和Bgl II，用于探针制备的限制位点; AAAAAAA，poly（A）。
  2. Osmyb4的表达：如所示，3日的水稻胚芽鞘被施加胁迫或激素处理。 -O2，厌氧条件2小时（2小时）和10天（10天）。 制备RNA凝胶印迹（10mg）并与Osmyb4探针杂交（上图）; 显示溴化乙锭染色（下图）。

Myb4介导的不同启动子的瞬时激活

为了测试Myb4的反式激活能力，我们利用图2（a）中所示的质粒在不同植物物种的原生质体中进行瞬时转化测定。

我们首先使用含有三个Myb-和一个bZip结合位点的Phaseolus vulgaris的PAL2启动子（图2b）。苯丙氨酸解氨酶是由几种生物和非生物胁迫诱导产生的苯丙素代谢的中心酶（Hatton等，1995）。我们还测定了位于两种形式的PAL2启动子（mAC-I和mAC-II）不同Myb结合位点突变的Myb4反式激活能力（图2b）。我们观察到Myb4特异性地诱导，并且在烟草原生质体中由野生型PAL2启动子驱动的Gus表达增加了50％。在突变m AC-1中，Myb4诱导Gus表达增加75％，而在m AC-II中，Myb4反式激活被完全抑制（图3a）。 在拟南芥原生质体中，所有三种启动子的Myb4反式激活作用都较高; 然而，观察到所用启动子的类似反式激活依赖性（图3b）。

由于从水稻叶片分离原生质体的效率低，我们仅测试了Myb4对两种PAL2启动子突变体形式的作用。同样在这种情况下，我们在m AC-I启动子上发现了Myb4反式激活作用（约40％），而在m AC-II启动子上未检测到作用（图3c）。

图表 2 用于瞬时表达分析的质粒

（a）用于瞬时转化实验的质粒方案。 启动子点缀：35S，CaMV 35S; PAL2，野生型PAL2启动子; mAC-1，在AC-1区突变的PAL2启动子;mAC-II，在AC-II区突变的PAL2启动子;COR15，COR15a启动子; des，马铃薯ScD9 SAD启动子。 打开矩形代表ORF，阴影矩形代表Nos终止符。

（b）PAL2启动子野生型（WT）和突变（m AC-1和m AC-II）序列。 指出了Myb（AC）和B-zip（G-BOX）转录因子的结合位点。

图表 3 野生型和诱变的PAL2启动子上的Myb4反式激活

在烟草（a），拟南芥（b）和水稻（c）原生质体中测定Myb4反式激活活性。 空心条：在用PAL2GUS（WT），pPALm AC-IGus（m AC-1）或pPALm AC-IIGus（m AC-II）质粒转化的原生质体中检测到的Gus表达; 灰色柱：在用pMC MVMyb4和p PAL2GUS（WT），pPALm AC-IGus（m AC-1）或pPALm AC-IIGus（m AC-II）质粒转化的原生质体中检测到的Gus表达。

考虑由pPAL2Gmu;s（a，b）或pPALmAC-IGus（c）作为1驱动的表达，Gus活性值以任意单位表示。数据是四个（a，b）或三个（c）转化实验的平均值。 标明SD。

进一步的实验涉及Myb4在低温适应中的作用; 这些实验基于大麦的低温诱导基因paf93和cor14的上游基因组区域（Crosatti等，1999; Grossi等，1995）和Sc D9 SAD的上游基因组区域驱动的反式激活活性（Grillo等人，1998）。 所有这些5区域都具有假定的Myb转录因子结合位点，即使Myb介导的调控尚未被描述。

在冷处理或在Myb4存在下测试的两个大麦启动子不驱动Gus报道基因的可检测表达。

图4显示了烟草原生质体中ScD9 SAD启动子介导的绿色荧光蛋白（GFP）报道基因的表达。用图2（a）中所示的质粒转化的原生质体在标记的氨基酸混合物存在下于29℃孵育1小时。细胞提取物用抗GFP抗血清免疫沉淀法和荧光检测法检测沉淀的蛋白质（图4）。通过对三个独立实验的定量分析，使用作为GFP定量的内部标准的抗GFP抗血清免疫沉淀的交叉反应性多肽，记录对ScD9 SAD启动子的两倍Myb4诱导作用。 正如预期的那样，pCaMVMyb4转化的原生质体中不存在GFP（图4）。 GFP表达的增加并不取决于转化效率：一个有效的可重现的效率在57至63％之间的原生质体转化的方案，之前在我们的实验室中标准化（Locatelli等人，2003）。

图表 4 ScD9 SAD启动子上的Myb4反式激活

用抗GFP抗血清免疫沉淀来自烟草原生质体的体内标记蛋白质的荧光成像。 原生质体用pCaMVMyb4，pdesGFP和两者转化。 箭头表示GFP（a）和交叉反应性多肽（b）。

最后，我们测试了拟南芥，烟草和水稻原生质体中拟南芥COR15a基因启动子上Myb4的反式激活活性。 尽管COR15a启动子不含有假定的Myb因子结合位点，但是通过评估该启动子上的Myb4作用的是为了通过低温和其他非生物胁迫来控制其诱导性（Artus等，1996）。正如预期的那样，在双子叶系统中，通过运用转化原生质体的方法（PEG-介导的DNA摄取）对细胞引起渗透胁迫，发现了高水平的COR15a驱动的Gus表达。在拟南芥和烟草原生质体中，Myb4诱导Gus表达增加约30—40％，即使这种增加很小，结果也是特异性和可重复的（图5）。

图表 5 拟南芥和烟草原生质体中COR15a启动子上的Myb4反式激活

空心条：用pCOR15aGus质粒转化的原生质体中的Gus表达; 灰色柱：在用pCOR15aGus和pCaMVMyb4质粒转化的原生质体中检测到Gus表达。考虑到由pCOR15aGus驱动的表达，Gus活性值以任意单位表示。数据是四次转化实验的手段。 标明SD。

我们还测试了水稻原生质体中COR15a启动子上的Myb4反式激活活性。 虽然使用pCaMVCat和pCaMVGus对照质粒的实验得到了表达，但我们没有观察到COR15a启动子驱动的Gus表达或Myb4反式激活。

过表达Osmyb4的拟南芥植物：形态效应

用在Ca MV 35S启动子控制下携带Osmyb4编码序列的双元载体转化拟南芥植物。对抗卡那霉素的42株T2植株中的23株，通过PCR证实转基因的存在。分析12个纯合的T3和T4系，通过Northern印迹分析每个品系的三个植物。在品系内，Osmyb4表达是恒定的，表明Osmyb4转录水平在品系间的差异取决于位置效应。 定义了三种不同类型的基因表达：极低表达（VLE），第15/8和第16/4行; 中等表达（ME），第15 / 6,3 / 7,22 / 1,33 / 19,3 / 20,3 / 18和14/1行; 高表达（HE），第2/1; 3/4和3/14行。在图6（a）中，将从一株植物中提取的每种转基因品系的RNA的Northern印迹与野生型进行比较。 Osmyb4特异性区域（图1a）和18S c DNA是探针。图6（b）显示了18S RNA上Osmyb4 mRNA的标准含量。VLE系表达了非常低水平的Osmyb4m RNA，其不能通过Northern印迹检测到，但能通过RT-PCR检测（数据未显示）。

转基因植物或多或少具有严重的矮小表型，这取决于Osmyb4的表达水平（图6c）。 此外，Osmyb4表达影响植株的大小，但不影响植物器官的数量（表1

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 13 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[281968]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。

您可能感兴趣的文章