被修饰的细菌人工染色体在 斑马鱼转基因中的应用外文翻译资料

 2023-01-07 15:44:33

被修饰的细菌人工染色体在

斑马鱼转基因中的应用

Zhongan Yanga,Hong Jiana,Thawinee Chachainasakula,Shiaoching Gongb,Xiangdong William Yangc,Nathaniel Heintzb,Shuo Lina

a Department of Molecular,Cell and Developmental Biology,University of California,Los Angeles,CA 90095-1606,USA

b Laboratory of Molecular Biology,Howard Hughes Medical Institute,The Rockefeller University, New York, NY 10021,USA

c Brain Research Institute,University of California,Los Angeles,CA 90095-1606,USA

摘要：使用细菌人工染色体（BAC）的转基因技术为指导外源基因的有效表达提供了较高的保真度。在透明的斑马鱼中应用这种技术，并且结合荧光蛋白报告技术，可以实现前所未有的与生物体基因表达调控相关的视觉分析。这里，我们描述一种简化的操作步骤，先是直接从公共序列数据库选择多种BAC克隆，然后快速用GFP和RFP修饰，以用于斑马鱼转基因分析。本文详细介绍了BAC DNA制备的实验步骤、斑马鱼胚胎的显微注射技术以及携带GFP和RFP修饰的BAC克隆的转基因斑马鱼的筛选方法。

关键词：转基因斑马鱼；GFP；RFP；修饰；斑马鱼BAC和PAC

  1. 引言

斑马鱼是一类极好的模型生物，它提供了一个独特的机会来整合正向遗传学、实验胚胎学、功能基因组学和分子生物学等工具，以了解脊椎动物的发育。此外，斑马鱼基因组测序计划即将完成。我们面临的挑战是去搞明白脊椎动物基因组中普遍包含的3万多个基因的表达、调控和功能。目前，涉及全胚胎RNA原位杂交的方法中，利用质粒报告基因和正向遗传学的转基因方法是解决斑马鱼和其他生物中这些基本问题的流行工具。关于表达分析，全胚胎RNA原位杂交缺乏分辨率，而且需要固定胚胎，而目前的转基因技术由于缺乏基因组序列的调控，往往缺乏保真度来重现内源性基因表达模式[1-5]。

在各种生物中获得的许多例子表明，细菌人工染色体(BAC)转基因是一种指导转基因表达的更有效的方法。BACs是可以容纳上至300kb大基因组DNA的克隆载体。在大多数情况下，BAC的转基因结构比更小的插入载体更能指导转基因表达，因为它们可以容纳数万或者数十万碱基对的末端调控序列[6,7]。在过去的几年里，已经建立了几种基于同源重组的修饰BACs的方法，允许在精准的位置将转基因插入到大的DNA片段中[8-10]。我们先前已经使用了一种改造BACs有效方法，来对小鼠神经元基因的表达进行高通量的转基因研究[11]。同时，我们在斑马鱼上测试了这种方法，而且修饰了100多种BAC克隆，以用于不同的斑马鱼基因。本文详细地介绍了BAC转基因的步骤，包括从基因组序列中筛选BAC克隆，用大肠杆菌介导GFP或RFP插入BAC，以及在受精卵中注射被修饰的BAC DNA来获得转基因斑马鱼。

  1. 鉴定含有目的基因的BAC克隆

斑马鱼基因组BAC文库CHORI-211是桑格研究机构(http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/libRary_details.shtmL)斑马鱼基因组测序计划中使用的BAC文库之一。我们关注的是如何从这个文库中选择理想的BAC克隆，因为许多实验室内部都有它，或者个别的克隆可以从BACPAC资源中心(http://bacpac.chori.org/)购买。用 cDNA文库或者部分基因组片段的目的基因序列运行BLAST搜索，因为该工具使用了最新的斑马鱼基因组信息。在写本文的同时，当前的程序组件是斑马鱼的Zv5数据库(http://www.ensembl.org/Danio_rerio/)。Contig View可以以显示基因在叠连群上的位置。首先在“Decorations”下拉菜单中选择“BAC Ends”，在“Jump to region”扩展序列区域覆盖整个序列或单个叠连群的约400kb长的序列，刷新网页，确定相应基因的克隆名或BAC的ID号。如果没有发现直接覆盖该基因的BAC克隆，则可以选择几个附近的BAC克隆，其末端位于靶基因的200kb以内，然后进行PCR分析。一旦被确认，含有一个目的基因的BAC克隆就可以用于进一步的修饰（图1）。

图1.用于从CHROI-211文库中识别相应的BAC克隆的流程图目的基因的cDNA序列通常是可用从文库中取用的，或者可以从搜索ZFIN和NCBI数据库中获得。 然后从桑格研究所、UCSC、ZFIN和NCBI的网站上获得这些基因的基因组序列。 在某些情况下，目的基因的基因组序列可以直接从网站上通过搜索基因名获得。该基因在适当的染色体、支架和支链的位置可以通过在桑格研究所网站（1）http://www.ensembl.org/Multi/blastview?species D Danio_rerio)执行一个Blast/SSAHA搜索获得。如本文所述，通过选择““ContigView”，然后检查“Decorations”下拉菜单中的“BAC Ends”，可以获得位于目的基因周围区域的相应BAC克隆或BAC末端。然后，从CHORI-211文库中选择相应的BAC克隆。使用克隆名称作为登录号，通过搜索克隆状态数据库（2）the Clone Status database (2) http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/humpub/clone_status?species D ZebraWsh)获得BAC克隆。如果在CHORI-211文库以外的文库中找到BAC克隆，可以通过搜索Zebrafish fpc(Zebrafish Genome Fingerprinting projec数据库(3) http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/WebFPC/zebraWsh/small.shtml,http://www.sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/WebFPC/zebraWsh/large.shtml))获得相应的CHORI-211 BACs。

如果克隆名称可用，它们可以用作登录号来搜索Clone Status 数据库(http://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/humpub/clone_status?species DZebraWsh)。这允许用户从CHORI-211文库中识别BAC的ID号。如果通过此搜索识别的BAC克隆不是来自CHORI-211文库，则可以使用斑马鱼fpc数据库(http://www. sanger.ac.uk/Projects/D_rerio/WebFPC/zebraWsh/large.shtmL or http://www.sanger. ac.uk/Projects/D_rerio/WebFPC/zebraWsh/small.shtmL)进一步在线搜索。这第二次搜索通常允许识别与目的基因相关的额外的CHORI-211 BAC克隆。如果没有，来自CHORI-73、DKEYP或DKEYBAC 文库的BAC克隆也可以直接用于修饰。

在BlastView窗口中，在每个基因的ATG起始密码子上游选中大约1kb的基因组序列，并选择“导出序列”来设计PCR引物。用该基因的特异性引物进行PCR验证，以确认所需的BACs。到目前为止，我们已经获得约80%的需要被修饰的基因的CHORI-211文库的 BAC克隆。

  1. 通过插入GFP、RFP报告基因或其他转基因来修饰BAC
    1. BAC鉴定的引物设计以及A box的构建

为了获得相应BAC克隆的PCR结果，设计了两个引物(引物A3R和A5Asc）。引物A3R为3rsquo;反向引物，位于5rsquo;末端，靠近目的基因的ATG起始密码子。引物A5Asc，即5rsquo;正向引物，位于反向引物上游300-500bp处，包含Asc I限制性酶切位点的序列。这个PCR片段叫做“A盒”，用于修饰过程，而BAC上相应的基因组序列被称为“Arsquo;盒”。位于Arsquo;盒外侧和上游约100bp的另一个5rsquo;正向引物(引物A5F）可以用于去检测同源重组后被特殊修饰的BAC克隆。

    1. 具有GFP/RFP报告基因的斑马鱼BAC克隆的改造

我们已经成功地用包括GFP、RFP和癌基因在内的多个转基因改造修饰了BAC克隆。在这里，我们以GFP/RFP为例来描述这个过程（图2）。

图2.斑马鱼BAC克隆的修饰。（1）对于靶基因翻译5rsquo;端起始密码子相邻的一个基因组序列片段进行PCR扩增并将该PCR片段连接到靶载体中GFP报告基因的上游。（2）将携带Rec A基因的质粒转进BAC宿主细胞。该质粒含有四环素抗性基因(Tt)和温度敏感的复制起始位点(T)。（3）将携带GFP和A box的靶向载体通过电导法转入含有BAC克隆和Rec A质粒的大肠杆菌细胞中。随着Rec A的瞬态表达，在A box和Arsquo; box之间发生同源重组。（4）通过同源重组，靶载体被整合到BAC克隆中。用氯霉素和抗生素氨苄青霉素对BAC克隆进行双重筛选。 黑盒：靶向基因的编码区；开盒：UTR；灰盒：靶向载体中的盒或BAC中插入的Arsquo;盒；(T)：Rec A质粒中温度敏感的复制起始位点。

3.2.1携带GFP/RFP报告基因的靶向载体的构建

用上述引物从靶向基因的BAC基因组序列中扩增出PCR片段(300-500bp)，用AscI酶切，并连接到靶向载体pLD53.SC2[9,10]上，该载体含有GFP或RFP，并被限制酶AscI和SmaI预先酶切消化过。因此，PCR片段位于GFP或RFP报告基因的上游，并提供了可供重组的同源末端。携带A盒的靶向载体被转入能与在其复制起点共存兼容并存的pir 2细胞，然后使用来自Qiagen的高速Maxiprep试剂盒制备R6kgamma;和DNA。

3.2.2 Rec A质粒的转化

将含有细菌Rec A基因的质粒转入原始BAC宿主细胞，瞬时表达Rec A酶，促进同源重组。该质粒携带一个四环素抗性基因和一个温度敏感的复制起点，可以按照大肠杆菌细胞的标准mini-prep协议制备，方法是在30°C下、含有5 mg/mL四环素的LB培养基中培养细胞。含有目的BAC克隆的大肠杆菌细胞被接种到4 mL的LB培养基中，37 ℃下在摇床中孵化。当OD值达到0.3-0.5时，将4mL培养液在冰上冷冻至少10 min，将大肠杆菌细胞收集在2个离心管（1.5 mL）中，在4°C、5500转/min下离心10 min。每个离心管中的细胞用1.5 mL冰冷的50 mMCaCl2溶液重新悬浮，在冰上孵育5 min。在相同条件下再次离心后，将细胞收集并重新悬浮在150 mu;l冰冷的50 mMCaCl2溶液中，其中含有10%甘油，分配到3个预冷的离心管中。然后将Rec A质粒DNA(2-3 mu;l)加入到其中一份试样中，在冰上孵育30 min。在42 ℃加热90 s后，加入800 mu;l的SOC培养基，在37℃，225转/min摇床中孵化细胞1 h。将大肠杆菌细胞接种到含有氯霉素（25 mg/mL)和四环素(5 mg/mL）的LB/琼脂平板上，在30°C下孵育过夜。额外的活性细胞可以储存在-80°C冰箱。

3.2.3 同源重组及鉴定修饰过的BAC克隆

将含有靶向BAC克隆和Rec A质粒的大肠杆菌细胞接种含有2 mL氯霉素（25 mg/mL）和四环素（5mg/mL）的LB培养基中，并在30 ℃摇床中孵化过夜。将1 mL的过夜LB培养物转移到100mL含有相同的抗生素LB培养基中，在30 ℃下以300转/min摇晃培养。当OD值达到0.5-0.7时，将100mL的培养物在冰上冷冻至少15min，并通过离心法收集大肠杆菌细胞。细胞重新悬浮在100mL冰冷的10%甘油中，再离心。重复洗涤一次，然后再将大肠杆菌细胞悬浮在200 mu;l 10%甘油中。一个40 mu;l的试样被转移到一个预冷的1.5 mL离心管中，并与2 mu;l预制的靶向载体(1 mu;gDNA)混合。然后使用带有1 mm立管（布林克曼仪器）的电穿孔器2510（布林克曼仪器）预制电穿孔。电穿孔在1800 kV时预先形成，然后大肠杆菌细胞与1 mL SOC培养基混合并转移到细菌培养管中。在37 ℃、225转/min摇床培养1 h后，5500转/min离心 5min收集细胞，转移至5 mL含有氯霉素（25 mg/mL）、氨苄西林（50 mg/mL）和四环素（5 mg/mL）的LB培养基中，然后在30 ℃，300转/min摇床中发酵过夜。将10、50和100 mu;l的大肠杆菌细胞涂布到含有氯霉素(25 mg/mL)和氨苄西林(50 mg/mL)的LB/琼脂平板上，在43°C下

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