海藻糖转运体敲除对冈比亚按蚊应激适应和恶性疟原虫感染易感性的影响外文翻译资料

 2023-01-07 15:46:39

海藻糖转运体敲除对冈比亚按蚊应激适应和恶性疟原虫感染易感性的影响

原文作者 Kun Liu , Yuemei Dong , Yuzheng Huang , Jason L. Rasgon , and Peter Agre

摘要:冈比亚按蚊是恶性疟原虫的主要媒介蚊子,这种致命病原体导致了撒哈拉以南非洲大多数的人类疟疾。而在脂肪体内合成的海藻糖是蚊子血淋巴中的主要糖,它不仅提供能量,还保护蚊子免受干燥和热应激。海藻糖通过海藻糖转运蛋白AgTreT1进入蚊子血淋巴。成年雌性冈比亚按蚊中AgTreT1主要在脂肪体中表达。我们发现AgTreT1表达是由环境压力(例如低湿度或高温)诱导的。AgTreT1 RNA沉默使血淋巴海藻糖浓度降低40%,且使蚊子在干燥或受热后更快死亡。感染性血粉后,与模拟注射的蚊子相比,AgTreT1 RNA沉默使蚊子中肠中恶性疟原虫卵囊的数量减少了70%以上。这些数据揭示了AgTreT1在主要媒介蚊子的压力适应和疟疾病原体发展中的重要作用。因此,AgTreT1可能是控制疟疾媒介的潜在目标。

关键词:主要血淋巴糖; 糖转运蛋白; 疟疾寄生虫卵囊; 疟疾控制

冈比亚按蚊是恶性疟原虫的主要载体,对疟疾传播周期至关重要,这种病原体是撒哈拉以南非洲大多数恶性疟疾的罪魁祸首。在疟疾流行地区,媒介蚊子能在剧烈波动的温度和湿度中存活。蚊子通过调节某些基因的表达水平来适应环境变化;然而,大多数保护机制显然仍然未知。最近,我们研究了冈比亚按蚊的水通道蛋白水通道(AgAQP1),该通道对于水稳态很重要,因为减少其表达可防止脱水。由于水分流失对蚊子的生理有着深远的影响,我们研究了其他可能防止环境压力并可能影响恶性疟原虫传播的候选基因。

海藻糖是通过alpha; – alpha; - 1,1-糖苷键连接的两个葡萄糖分子的非还原性二糖,在昆虫,甲壳类动物,线虫,细菌,真菌和植物,除脊椎动物外中富含。海藻糖作为蚊子血淋巴中的主要糖,其浓度比葡萄糖或其他糖高10倍以上。海藻糖是一种多功能分子,由于其独特的化学和物理性质,水合体积大,缺乏内部氢键和不还原,因此可作为主要的储能物质以及细胞膜和蛋白质的稳定介质。

在几种刺激因素——干燥,加热,冷冻,高渗和氧化作用下,海藻糖水平急剧上升。在酵母和植物中,海藻糖也是影响生长的代谢途径中的信号分子。有证据表明海藻糖可以保护培养的细胞。表达果蝇海藻糖磷酸合酶1的HEK-293细胞中海藻糖的增加可保护细胞免受缺氧损伤。用海藻糖培养的牛内皮细胞系,然后在用海藻糖配制的溶液中冷冻保存,细胞存活超过80%。Polypedilum vanderplanki(睡眠摇蚊)脱水阶段幼虫的海藻糖水平迅速积累至干体重的约20%,比淡水中幼虫高出5倍以上。此外,最近的一项研究表明,将 D -( )-海藻糖注射到头部完整,饥饿的蟑螂的血腔中可降低血淋巴中短神经肽F的含量,暗示海藻糖在调节脑和中肠昆虫消化和营养相关行为的相互作用中的新作用。海藻糖仅在蚊子的脂肪体中合成,被运送到循环血淋巴以递送到其他组织,该过程涉及海藻糖转运蛋白TreT促进的海藻糖穿过细胞膜的特定运动。来自冈比亚按蚊的AgTreT1 cDNA是来自P.vanderplankiPvTreT1的直系同源物。冈比亚按蚊基因组中仅存在一种TreT基因,其海藻糖转运功能的特征在于非洲爪蟾卵母细胞中的异源表达。有人提出PvTreT1有助于体内P.vanderplanki幼虫的脱水抗性。然而,没有直接证据支持AgTreT1在冈比亚按蚊中的这种作用。

海藻糖可能是冈比亚按蚊中疟原虫病原体的能量来源。摄入受感染的血粉后,疟原虫配子体分化为雄性或雌性配子并在蚊子中肠融合形成合子。可移动合子穿透肠道内层在基底层产生卵囊。在卵囊阶段,疟疾对位放大数千倍,从载体中清除能量。据报道,疟原虫感染会消耗载体血淋巴中的糖,这表明海藻糖被寄生虫用于快速生长。与海藻糖转运和代谢有关的基因可能与蚊媒中的疟原虫的生命周期有关。

在这项研究中,我们观察到AgTreT1表达是由干燥和加热诱导的。通过RNAi降低雌性冈比亚按蚊中的AgTreT1表达可降低血淋巴海藻糖水平。在干燥或炎热的环境中,AgTreT1水平降低的蚊子比对照更早死亡。此外,当AgTreT1在感染恶性疟原虫的冈比亚按蚊中沉默时,中肠中出现的寄生虫卵囊明显少于对照蚊子的中肠。这些数据表明AgTreT1在干燥和加热过程中维持载体血淋巴糖水平的重要作用,并揭示了在卵囊期恶性疟原虫繁殖中的独特功能。

结果

AgTreT1的发育和组织特异性表达。通过定量RT-PCR在冈比亚按蚊中表征AgTreT1表达。从不同生命阶段的蚊子中提取总RNA。在四龄幼虫,蛹以及7日和14日龄成年雌蚊中组成性检测到AgTreT1 mRNA表达(图1A)。从7日龄雌性中解剖组织,因为它们已经能够吸血。脂肪体中的AgTreT1 mRNA水平比整个头部,肠道,马尔皮基小管或卵巢中的AgTreT1 mRNA水平高四倍以上(图1B)。

然后在模拟环境应力的条件下研究表达。暴露于42%相对湿度的冈比亚蚊子的AgTreT1 mRNA水平是正常培养物中残留的对照蚊子的2.5倍,相对湿度为80%(图1C)。暴露于37°C的蚊子的AgTreT1 mRNA水平略有升高,达到正常培养温度27°C下剩余对照的1.15倍(图1D)。应激处理2天后,提取蚊子血淋巴并测量海藻糖。42%相对湿度下的海藻糖浓度增加到80%相对湿度下对照水平的2.6plusmn;0.02倍;37℃时海藻糖浓度增加到27℃对照的1.9plusmn;0.01倍。

图1。AgTreT1的表达谱。RT-qPCR显示AgTreT1(A)在不同发育阶段的表达四龄幼虫,蛹,7日龄和14日龄雌性成虫;(B)在7日龄雌性成虫解剖的不同组织脂肪体,全肠,全头,马氏管,卵巢;(C)在脱水(42%)或正常(80%)相对湿度下;(D)在高(37℃)或正常(27℃)环境温度下。使用S7核糖体基因作为内部对照标准化cDNA水平。数据表示通过Students t检验的平均值plusmn;SD,*Ple;0.05,**Ple;0.01。

通过AgTreT1维持血淋巴海藻糖浓度。为了特异性降低AgTreT1的表达,将双链RNA(dsRNA)体外转录并注射到4至6日龄成年雌蚊的胸腔中。注射dsRNA后第1天至第6天,定量RT-PCR显示,注射GFP dsRNA的相应对照蚊子中AgTreT1 mRNA降低至水平的16%(图2A)。为了确认蛋白质水平上的RNA沉默效率,我们提出了一种兔多克隆抗体,该抗体特异性识别表观分子量为43 kDa的AgTreT1条带,而免疫前血清则没有。蛋白质印迹显示AgTreT1 dsRNA注射导致蛋白质水平显着降低(图2,插图)。

图2。AgTreT1沉默影响血淋巴海藻糖水平。(A) 注射后6 d,注射AgTreT1 dsRNA的蚊子中AgTreT1 mRNA水平降低至对照组的16%。将整个蚊子的RNA用于逆转录和定量PCR,并使用S7核糖体基因的表达作为内部对照对数据进行标准化。黑色条代表注射了AgTreT1 dsRNA的蚊子的标准化mRNA水平,灰色条代表注射了GFP dsRNA的蚊子作为对照。(插图)在注射后第0天(注射前)和注射后第2,4和9天注射GFP RNAi或AgTreT1 RNAi的全雌性冈比亚冈比亚冈比亚的Western印迹。(上)针对抗AgTreT1抗体的印迹。(下)针对抗肌动蛋白抗体的印迹。(B) 注射后8 d,AgTreT1或GFP dsRNA注射的冈比亚冈比亚蚊子中血淋巴海藻糖的相对浓度。将海藻糖浓度标准化为从血淋巴细胞提取的基因组DNA。数据代表平均值plusmn;SD,*Ple;0.05通过Students t检验。

注射后8天进行表型分析以允许蛋白质更新。如果AgTreT1在海藻糖从脂肪体向血淋巴的转运中起作用,我们预计AgTreT1的减少会降低血淋巴中海藻糖的浓度。为了验证这一假设,提取基本上含有血淋巴血浆和血细胞的蚊子体液,并测量相对海藻糖浓度。在注射AgTreT1 dsRNA的蚊子中,与对照相比,血淋巴海藻糖水平降低了40%(图2B),证实了AgTreT1在促进海藻糖从脂肪体向血淋巴。使用注射GFP dsRNA作为参考的对照蚊子的血淋巴渗透压,与对照组相比,AgTreT1沉默蚊子的正常血淋巴渗透压降低了14%

AgTreT1缺陷型蚊子在环境压力下的生存能力。虽然人们认为海藻糖可以作为许多物种免受各种压力的保护剂,但在整个生物体的水平上缺乏直接的证据。在这里,我们通过用RNAi沉默AgTreT1表达来降低冈比亚冈比亚血淋巴中的海藻糖浓度。雌性冈比亚冈比亚蚊子注射了AgTreT1 dsRNA,8天后,与注射GFP dsRNA的对照蚊子相比,它们在干燥条件下(lt;20%相对湿度)进行了测试。一起孵育时,注射AgTreT1 dsRNA的蚊子始终在对照蚊子之前死亡。代表性实验显示在图3A中,并且具有相似趋势的三个重复总结在表S1中。

显示了对照(GFP RNAi)或AgTret1 RNAi组中的总蚊虫数以及三个实验中存活分析的相应P值。*的实验被选为图3a和B中的代表性图。

在疟疾流行地区,39°C及以上的高环境温度并不少见,特别是在非洲的旱季。雌性冈比亚按蚊注射AgTreT1 dsRNA或GFP dsRNA。八天后,测试两组的热存活能力(39℃),这远高于正常的实验室饲养温度(27℃)。两组的相对湿度保持在80%。在39°C下,注射AgTreT1 dsRNA的蚊子始终在对照GFP dsRNA注射的蚊子之前死亡。代表性的存活图显示在图3B中,并且具有相似趋势的三个实验总结在表S1中。为了证实蚊子死于热量而不仅仅是由于AgTreT1的减少,我们在注射后第6天至第7天在27℃孵育基因沉默的蚊子,并且我们没有观察到显着的蚊子死亡。

AgTreT1缺陷型蚊子中的疟疾卵囊。虽然仍然缺乏直接证据,但啮齿动物寄生虫伯氏疟原虫被认为使用海藻糖来生长和发育斯氏按蚊。在这项研究中,我们调查了人类疟疾寄生虫恶性疟原虫的生长是否受其天然载体冈比亚冈比亚海藻糖水平的影响。5日龄冈比亚冈比亚雌性通过膜喂养被恶性疟原虫GFP-3D7菌株感染。感染后1 d,RNAi使AgTreT1表达沉默。恶性疟原虫感染8天后,解剖蚊子中肠,在荧光显微镜下计数GFP-3D7卵囊。从三个相似的实验中选择了一个代表性图(图4),揭示了AgTreT1缺陷型蚊子中卵囊的平均数量显着少于对照蚊子。表S2总结了三个实验的结果。GFP RNAi对照组的未感染蚊子比率(31.1%)低于AgTreT1 RNAi蚊子(43.5%),表明AgTreT1减少的蚊子的感染率较低。

显示了三个生物学重复实验中每个中肠的平均卵囊,对照(GFP RNAi)或AgTret1 RNAi组的蚊子数量以及非参数Mann-Whitney U检验的相应P值。*的实验被选为图4中的代表性图。

图3。在环境胁迫下沉默AgTreT1表达的蚊子的存活。将雌性冈比亚冈比亚蚊子在(A)脱水(lt;20%相对湿度)或(B)高温环境(39℃)中温育过夜。通过RT-qPCR和Western印迹证实AgTreT1的减少。实心三角形表示在指定时间点注射GFP dsRNA的活蚊的百分比,空心圆表示注射AgTreT1 dsRNA的活蚊的百分比。在干燥(A)和热应激(B)下,AgTreT1表达降低的蚊子比对照更早死亡。*生存分析中对数秩检验Ple;0.05。每个图都是具有相似趋势的三个不同实验的代表。表S1总结了三次重复的样品大小和P值。

图4.AgTreT1沉默的蚊子中的恶性疟原虫卵囊。雌性冈比亚按蚊感染恶性疟原虫GFP-3D7寄生虫,第二天将靶向AgTreT1或GFP的dsRNA注射到蚊子胸腔中。在感染后8天计数解剖的蚊子中肠中的卵囊数。实心三角形表示注射GFP dsRNA的个体蚊子中的卵囊数目,并且空心圆圈表示在代表性实验中注射AgTreT1 dsRNA的蚊子中的卵囊。水平线表示平均值。**Mann-Whitney U检验Ple;0.01。表S2总结了具有类似趋势的三个实验。

讨论

海藻糖防止干燥和高温。在这项研究中,我们发现海藻糖是冈比亚按蚊血淋巴中丰富的渗透压剂,

剩余内容已隐藏,支付完成后下载完整资料


英语原文共 6 页,剩余内容已隐藏,支付完成后下载完整资料


资料编号:[271463],资料为PDF文档或Word文档,PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏,您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容!立即支付

以上是毕业论文外文翻译,课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。