别藻蓝蛋白吸收远红光的结构基础外文翻译资料

 2023-01-07 15:55:21

别藻蓝蛋白吸收远红光的结构基础

Nathan Soulier1· Donald A. Bryant1,2,3

1 Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA

2 Department of Chemistry and Biochemistry, Montana State University, Bozeman, MT 59717, USA

3 S-002 Frear Laboratory, Dept. of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA

摘要：藻胆体(PBS)是蓝细菌主要的光收集天线，是由无色连接物和异质二聚体构成的超分子复合物，由色素结合藻胆蛋白构成。外周棒通常由藻蓝蛋白和藻红蛋白组成，多圆柱形核心主要由别藻蓝蛋白(AP)组装而成。每个别藻蓝蛋白亚基都结合一个藻蓝素 (PCB)生色团，这是一种线性四吡咯，主要吸收可见光谱中的橙红色区域(600-700 nm)。AP促进了激发能从藻胆体外围棒或从直接吸收的红光到光合系统中附属叶绿素的转移。结合PCB并能吸收远红光( FRL，700 ~ 800 nm )的AP的旁系形式最近在执行两类光积累的生物体中被发现：远红外光光适应( FaRLiP )和弱光光适应( LoLiP )。嗜热LoLiP菌株集胞藻6803(Synechococcus sp)中吸收FRL的AP（FRL-AP）的A1463被选择作为位点特异性诱变的平台，以探究吸收可见光区域的AP与吸收远红光的别藻蓝蛋白（FRL-AP）的结构差异和鉴定远红光吸光度表型必需的残基。同时，用来自同一生物的吸收红光的藻蓝蛋白-B (AP-B;~ 670 nm)作为创建FRL-AP的平台。我们证明了alpha;亚基上PCB的吡咯环A周围的蛋白环境是FRL- APs吸收FRL的主要原因。我们还发现，三聚体AP配合物中与相邻前聚体alpha;和beta;亚基结合的PCBs相互作用导致了大约20 nm的大红移和长波吸收带的明显锐化。

关键词：光合作用 藻胆蛋白 藻胆体 远红光光适应 弱光光适应 定点诱变 藻蓝蛋白

简介：藻胆蛋白( PBPs )是一种在蓝藻和红藻中组装成精细、超分子捕光天线复合体——藻胆体( PBS )的有色蛋白质。PBP从称为胆素的共价结合的线性四吡咯发色团种获得颜色。胆素发色团的数量和类型以及它们与PBP结合时所处的环境，决定了每个特定藻胆蛋白的吸光度和荧光性质。PBS中从高能量到低能量的PBP的整体组织有助于吸收光的激发能量快速、高效、定向地转移到光系统的附属叶绿素中，这些叶绿素嵌入在藻胆体下面的类囊体膜中，并与细胞质表面结合。

所有PBP都是alpha;和beta;两个亚基的异二聚体，(alpha;beta;)前聚体进一步组装成环状三聚体(alpha;beta;)3或藻蓝蛋白和藻红蛋白的六聚体(alpha;beta;)6。PBS核心子结构的外围棒和圆柱体是由PBP环形体堆叠而成的。外周棒由藻蓝蛋白(lambda;max ~ 620 nm)组成，有时也有藻红蛋白(lambda;max ~ 560 nm)或藻红蓝蛋白(lambda;max ~ 575 nm)。AP构成了大部分的多圆柱体核心亚结构。藻胆体核心蛋白可以进一步分为三种类型：初级或“块状”核心别藻蓝蛋白(ApcA1-ApcB1;lambda;max ~ 650 nm;图1d、S1）和两个特殊的末端发射器AP-B(ApcD1ApcB1， lambda;max ~ 670和618 nm;图1d、S1;）和LCM，一种具有N端结构域的连接蛋白，类似别藻蓝蛋白的alpha;亚基(ApcE1;lambda;max ~ 665 nm）。

图1 PCB平面度与吸光度的关系。a三种PBPs中PCB分子的晶体结构:来自条斑紫菜的ApcB1(绿色),来自Cyanidium caldarium的CpcA1（一种红藻/类蓝藻）(黄色),来自条斑紫菜的ApcA1(橘色），来自集胞藻6803（一种单细胞蓝藻，能进行放氧光合作用）的ApcD1(红色），以及一个假想的“平坦”PCB，可能类似于FRL-APs alpha;亚基中的PCB，如ApcD4(暗红色)。吡咯环标记为A、B、C和D。PCB通过硫醚键连接到环A的乙烯基侧链的C31原子上，PBP中的一个保守半胱氨酸。b从每个分子的吡咯环和它们之间的夹角推断出的环平面，从上到下平面度增加。c与面板a中相同的5个PCB分子的顶面向视图。d与PCB结构对应但来自不同生物体的代表性PBPs的吸收光谱。这些光谱显示了四个PCB环的平面度与长波长吸光度之间的直接关系。Leptolyngbya sp. JSC-1中的ApcB1和ApcA1-ApcB1均在大肠杆菌中异源表达并经IMAC纯化后获得上述光谱。CpcA1-CpcB1从含有聚球菌PCC 7002细胞裂解液的蔗糖密度梯度上蓝色条带中分离得到。除ApcB1外，其他光谱均为alpha;-beta;亚基复合物的产物。异质齐聚作用使吸光度的最大值比单体或单一亚基类型的低聚物转移到更长的波长。

藻蓝蛋白和所有别藻蓝蛋白亚基结合藻蓝素(PCB)，但每个PBP内发色团环境的差异导致这些蛋白的光谱性质差异较大。胆素构象是指将胆素伸展成延伸的构象和发色团的“扁平化”，以增加吡咯环的平面度，是通过有效地延伸发色团中的共轭系统决定蛋白质结合发色团吸收性质的重要因素。特别是PCB发色团的平面性被认为是产生AP (650nm)相对于AP-B（650nm;图S1）在吸光度最大值出现约20nm红移的最重要因素。在ApcE的胆蛋白结构域中，PCB发色团采用与光敏色素发色团相似的结构，这种构象明显增强了对更长的光波的吸收。

最近在一些蓝藻中发现了一种新型的光适应，它们可以根据FRL(700-800nm)改变光合装置，从而利用FRL进行光合作用。远红光光适应(FaRLiP)的能力取决于是否存在由FRL跨膜激活的保守的20基因簇，该基因簇编码光系统Ⅰ、光系统Ⅱ和PBS核心蛋白的亚基。在改造后的光合装置中，含有旁系的、吸收FRL的PBPs时，旁系的光系统亚基及其结合的Chl f和Chl d色素能够利用FRL进行光合作用。FaRLiP基因簇编码alpha;型AP亚基的3个对位基因( apcD5、apcD2、apcD3 )、beta;型AP亚基的1个基因(apcB2)和ApcE1 (apcE2)。由此产生的PBPs以及它们组装的复合物已经被证明在几个FaRLiP菌株中能够吸收FRL。ApcE2通过非共价键结合的PCB分子吸收FRL，从而使PCB发色团保留一个额外的共轭双键。这种策略也可能被其他一些缺少典型PCB结合半胱氨酸的FRL-APalpha;-亚基所共享，如聚球菌PCC 7335中的ApcD3。然而，大多数ApcD3蛋白和所有已知的ApcD5和ApcD2蛋白都具有典型的与胆素结合Cys-78残基。此外，来自Leptolyngbya sp.JSC-1的FRL-APs已被证明具有与可见光表达的AP相同的翻译后修饰，这包括与其他对位AP亚基一样具有单一共价结合的PCB分子。这意味着FRL-APs的红移吸光度是其共价结合PCB生色团周围蛋白质环境变化的产物。

另一株FRL-AP是在63℃条件下从黄石国家公园蘑菇房泉分离得到的弱光适应菌株中鉴定的。这种FRL- AP，即ApcD4-ApcB3，与低光适应(LoLiP)有关，导致细胞在低辐照度下产生FRL荧光发射特征。这种光合机构的修饰可能是为了改善其FRL富集的席生境中的生长，其中大部分可见光被生长在其上方的蓝藻和其他光养生物吸收（图1d和S1）。鉴于其热稳定性和在大肠杆菌中的高效异源表达，本研究以LoLiP聚球藻菌株A1463中的ApcD4-ApcB3（lambda;max=709 nm）和ApcD1-ApcB1（AP-B;lambda;max=670 nm）为平台进行定点突变，探究alpha;亚基PCB附近氨基酸与AP残基远红吸光度的关系。通过两种互补的、致突变的方法来确定FRL-APs中对FRL吸收有重要影响的残留物：干扰(或增强) ApcD4-ApcB3的FRL吸收和修饰ApcD1以吸收与ApcB1或ApcB3相关的FRL。

材料和方法

菌株信息和生长条件

利用大肠杆菌alpha;-选择银效率感受态细胞进行常规克隆和质粒制备。大肠杆菌菌株BL21 (DE3) 用于异源蛋白生产。大肠杆菌细胞在pH =7.0的添加了适当的抗生素的Luria-Bertani (LB)培养基中，30°C, 200 rpm的条件下振荡培养。如前所述，所有apc构建体在BL21-PBP平台菌株中转化并表达。

在大肠杆菌中异源产生AP和突变体AP的DNA构建

使用Q5 High Fidelity聚合酶Master Mix和表S1所列寡核苷酸引物，从Synechococcus A1463中扩增apc基因。在后续的PCR实验中使用表S2中的引物创建apc突变基因。设计了两个互补引物(上链和下链)，包括所需的DNA序列变化。以野生型基因扩增的PCR产物为模板，再进行两种反应:一种是基因正向引物和底链突变引物，另一种是基因上链突变引物和基因反向引物。这两种PCR产物包含有大约15个互补碱基(包括改变位点)，并与正向引物和反向引物结合作为最终PCR的模板，扩增出包含所需突变的全长基因。通过Gibson组装，将含有野生型或突变型序列的最终基因(或多个基因)插入到pAQ1Ex质粒的NdeI和BamHI酶切位点之间。两个质粒共同表达apo-AP亚基的生色磷酸化:质粒pTeCpcS编码的长形热聚球菌的cpcS胆素裂解酶基因，以及pPcyA质粒编码的大肠杆菌中PCB生物合成基因(ho1和pcyA)。

重组蛋白纯化和分子排阻色谱

每个重组蛋白都是在alpha;亚基上带有一个N端[His]10标记的异源合成的。将细胞悬液在124 MPa的冷冻法氏压力机中3次传代，得到细胞裂解液，超速离心澄清后，用固定化金属亲和层析( IMAC )纯化重组蛋白。采用分子排阻色谱对重组蛋白进行筛选纯化。

采用Auml;KTA Pure FPLC体系和 Superdex 200 10/300 GL柱(柱体积约为24 mL, 10 times; 300 mm)进行分子排阻色谱， 并在50 mM 的磷酸钾缓冲液(pH 7.0)、100 mm氯化钠和1% (w/v)甘油中平衡。将ApcD4-ApcB3和ApcD4-ApcB3 (C81A)的样品稀释至所需的浓度~ 3 mg mL-1，加样量为100mu;L。两个样品以0.5 ml min-1的流速进行色谱分析。分子量(MW)根据保留时间计算。柱用以下标准的低分子量和高分子量凝胶过滤试剂盒(Cytiva, Marlborough, MA)进行校准，标准包含:抑肽酶(6500)，核糖酶A(13700)，碳酸酐酶(29000)，卵清蛋白(44000)，伴清蛋白(75000)和醛缩酶(158000)。对于每种标准品，从洗脱体积计算凝胶相分布系数(Kav)，并通过绘制Kav与logMW生成校准曲线，其中Kav = 1.8803-0.299 (logMW)。使用这条曲线估计每个样品中蛋白质和蛋白质复合物的分子量。

吸收光谱和荧光光谱

用在线数据采集的Cary 14分光光度计获得吸收光谱。在低温(77 K)下，使用SLM 8000C荧光光谱仪测量每个蛋白质的荧光发射光谱。SLM 8000C荧光光谱仪经过改进，可由在线系统公司进行数字数据采集。为了优先激发PBPs，将激发波长设置为590 nm。将每个样品在1.5 M磷酸钾缓冲液(pH 7.0)中1:1稀释，然后测量低温荧光发射。

藻胆蛋白和蛋白结合藻蓝蛋白的建模

PBP亚基中的PBPs和PCB发色团嵌合模型采用以下晶体结构:来自PDB 1KN1:A,B的ApcA1和ApcB1 ，来自PDB 1PHN:A的CpcA1以及来自PDB 4PO5的ApcD1 。利用Chimera中的“调整扭转”工具，从PCB与ApcD1 结合的模型中创建了一个假设的平面PCB分子。利用I-Tasser软件，通过与聚胞菌PCC 6803 (PDB 4PO5:A,B) ApcD1和ApcB1晶体结构的比较，构建了A1463聚胞球菌ApcD4和ApcB3的同源模型。

序列标识创建

WebLogo 3.0用于生成包含13个ApcD1序列的序列logo和另一个包含13个FRL-APalpha;-亚基序列的序列logo。ApcD1序列从以下蓝藻中采集:Leptolyngbya sp. JSC-1 (WP_036003919.1), Synechococcus sp. PCC 7335 (WP_006454063.1), Synechococcus sp. A1463 (WP_011431562.1), Synechocystis sp. PCC 6803 (WP_010871516.1), Synechococcus sp. PCC 7002 (WP_012307741.1), Ch

剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

英语原文共 16 页，剩余内容已隐藏，支付完成后下载完整资料

资料编号：[271453]，资料为PDF文档或Word文档，PDF文档可免费转换为Word

原文和译文剩余内容已隐藏，您需要先支付 30元 才能查看原文和译文全部内容！立即支付

以上是毕业论文外文翻译，课题毕业论文、任务书、文献综述、开题报告、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。

您可能感兴趣的文章