发现眼镜王蛇毒液来自南洋和中国的地理变异 的功能蛋白质组学的方法外文翻译资料

 2023-01-10 16:16:20

杭 州 师 范 大 学

本科生毕业设计（论文）外文翻译

题 目

发现眼镜王蛇毒液来自南洋和中国的地理变异 的功能蛋白质组学的方法

本研究将眼镜王蛇的地理变异（眼镜王蛇）利用功能蛋白质组学的毒液。汇集了眼镜王蛇毒样品（简称OHV）分别来自印度尼西亚，马来西亚，泰国，和中国两个省，即广西和海南。使用两种动物模型来测试和比较致命的影响，我们发现，中国的Ohvs更致命的小鼠，而东南亚Ohvs更致命的蜥蜴（多线南蜥）。各种磷脂酶A 2（PLA 2 s），三指毒素（3ftxs）和Kunitz型抑制剂的纯化从这些Ohvs比较。除了中国人民PLA 2 s的OHV与已知序列，八军的新2从五OHV样本及其抗血小板活性进行比较。而两3ftxs（即oh-55和oh-27）是常见的在所有的Ohvs，不同的3ftx标记在中国和东南亚的Ohvs目前。所有的 Ohvs含有抑制剂的Kunitz，OH-TCI，而唯一Chinese Ohvs含有抑制剂的variant，Oh11-1。相对于含有更多的磷脂酶中国Ohvs，东南亚Ohvs有较高的金属蛋白酶，乙酰胆碱酯酶和碱性磷酸酶活性。

生物学意义

在五个国王眼镜蛇地理样本的显着变化，揭示了快速进化和动态平移调节的毒液可能适用于不同的猎物生态的老鼠和蜥蜴的致命测试证明。我们的研究结果预测眼镜王蛇伤到人和使用局部抗蛇毒血清治疗毒蛇咬伤的重要性可能的变化。

  1. 简介

眼镜蛇（眼镜王蛇）是目前的眼镜王蛇属的唯一成员，并且是最大的毒蛇在世界。这条蛇栖息于高原森林从印度，通过南洋，南中国的菲律宾[ 1 ]。在它的拉丁名字暗示，眼镜王蛇的主要食物来源是其他的蛇，但他们也捕食其他小型脊椎动物稀缺蛇时。许多蛇毒蛋白已被分离和特征从O.汉娜毒液（以下简称OHV），包括三指毒素（3ftxs）[2,3]，磷脂酶2（聚乳酸2）[ 7 - 4 ]，L-氨基酸氧化酶[ 8 ]，金属蛋白酶9，Kunitz型蛋白酶抑制剂[ 10 ]、[ 11 ]和因子X激活剂。几十位来自中国眼镜王蛇毒液腺3ftx cDNA已被克隆和测序，和大约20的3ftxs已经从蛇毒[2,3]分离。此外，中国Ohv PLA 2 s的车辆已经完全序列[ 7 ]。最近，一个基因组草图（1.36–1.59英镑）的印度尼西亚眼镜王蛇透露证据的重复和许多毒素和酶基因招聘毒腺，和PLA 2 s和3ftx基因家族[ 12 ]大规模扩张。

我们知道，种内变异的蛇毒成分可能存在，并且与变量如饮食、地理分布、发育及其他。以前的四东南亚OHV样品九酶活性比较没有解开他们的成分差异显著[ 13 ]。然而，大量的眼镜王蛇分布和缺乏蛋白质组学数据的东南部和南部的亚洲Ohvs值得仔细看看OHV生物多样性。

为了更好地理解地理变化，我们研究了混合的Ohvs来自印度尼西亚，马来西亚，泰国的蛋白质组，和两个中国省份，广西和海南。我们发现，在酶活性和类群特异性杀伤效力显著差异（对老鼠和蜥蜴）之间的中国和东南亚OHV样品。此外，我们纯化的各种异构体的解放军2，3ftxs Kunitz型蛋白酶抑制剂，并从这些高速公路车，并分析了其分子量，N-末端序列和生物学功能。结果，然后讨论了现有的OHV转录组和蛋白质组数据的光在OHV的地理变异与进化提供一个更广阔的视角。

  1. 材料与方法

2.1、毒液和试剂

冻干的OHV样品来自印度尼西亚、马来西亚和海南均购自latoxan（价，法国），分别来自medtoxin毒实验室（迪兰，佛罗里达州，美国），和新源蛇毒有限（广州，中国）。来自广西和泰国的高速公路车样本分别汇集了海岚博士礼品（南宁，中国）和新罕布什尔州谭教授（马来亚大学，kualalumpa，马来西亚）。广西阀门样本2011从五眼镜王蛇收集。然而，我们看不到多少条蛇被挤奶或分布的其他样本进行多宽。L -二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）是从阿凡提极性脂质（雪花石膏，铝，美国）。测序级胰蛋白酶购自Promega公司。（（麦迪逊，WI，美国）。脱氧胆酸钠，胶原蛋白，邻联茴香胺和其他有机化学品是从西格玛化工（圣路易斯，密苏里州，美国）。测序级氨，对硝基苯磷酸试剂级缓冲器和溶剂从默克（德国）。

2.2、蛋白质的测定和SDS-PAGE

可溶性粗毒和孤立的BCA蛋白定量定量蛋白（皮尔斯化工有限公司，罗克福德，IL，美国）使用牛血清白蛋白作为标准。准备SDS-PAGE分析样品，25mu;克蛇毒蛋白溶解在缓冲液中含有50 mM DTT和95°保温5分钟孵育，或缓冲液中不加还原剂，在室温下孵育。样品装载到4–12%聚丙烯酰胺凝胶（nupage双三凝胶，Invitrogen公司，美国）与MES缓冲液制备。电泳使用XCell surelocktrade;系统进行（Invitrogen公司，美国）在一个恒定的180 V电压经过电泳，凝胶用考马斯亮蓝染色。

2.3、对两模型动物的OHV致死效力

雄性ICR小鼠购自biolasco，公司（台北，台湾）。野生蜥蜴（多线南蜥）收集可能–2012十二月在屏东，台湾。小鼠的体重分别为25 - 35克，而那些蜥蜴是1.50 - 49.2克（平均为20.8克= 1.49克），81。动物被关在12 / 12人/暗周期型°C与世界卫生组织的国际指导原则根据动物研究水和食物食（谁报，1985）。每个实验组包含四个动物。每一个地理OHV样本设计剂量溶于100mu;L（小鼠）或40mu;L（蜥蜴）PBS缓冲液，注射到动物体内。动物被观察到24小时后，注射，和死亡的数量被记录。估计从最低剂量，导致死亡的至少2次注射动物，或通过插值的数据相关的死亡和剂量的剂量的表观的致死剂量。

2.4、四种酶的体外实验研究

L-氨基酸氧化酶（LAAO）确定为先前描述的[ 14 ]稍加修改的活性。含0.1 M Tris HCl缓冲–反应混合物（pH值7.5），150毫米NaCl，1毫米L-亮氨酸、辣根过氧化物酶400亩，和10毫米的邻联茴香胺（基过氧化物酶）进行恒温在25°C和毒液样本加入到引发反应。初始速率随访tometrically在436 nm处的5分钟一个单元分光光度法（U）活动定义为酶氧化每分钟使用摩尔消光系数基板1 nmol量8.3times;10 3米minus;1厘米minus;1。

碱性磷酸酶、碱性磷酸酶（ALP）用96孔板[ 15 ]的活性测定。毒液（5mu;L 5mu;G）加入到含25mu;l 0.01 m对硝基苯磷酸的混合物，15mu;l 0.01 m和25mu;MgSO 4 L 0.5 M甘氨酸缓冲液（pH 8.5），分别在37°C 15分钟100mu;L 0.2 N NaOH测定在400 nm处的吸光度。基于摩尔对硝基苯酚1.8times;10 4米minus;1厘米minus;1吸收系数计算的具体活。

酰胆碱酯酶（AChE）96孔微孔板使用0.01–3毫米碘化硫代乙酰胆碱作为200mu;L 10 mM磷酸钠底物测定活性的OHV（pH 7.5）在25°C在0.04米的MgCl 2和0.2毫米的存在（′5,5-二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）[ 16）]。最佳底物浓度为1.5至0.5毫米。反应监测在405 nm处使用1.5毫米乙酰胆碱为底物，和具体的活动是基于对硝基苯甲酸1.4times;10 4米minus;1厘米minus;1摩尔吸收系数计算。

采用比色法测定蛋白酶活性[ 17 ]对酪蛋白。含0.1mu;克蛇毒在50 mM Tris HCl缓冲–0.5毫克的酪蛋白反应混合物100mu;L（pH 8）孵育37°C 90分钟。反应中加入200mu;L为5%的三氯乙酸停止。1000克5分钟的旋转，150mu;L上清液用0.5 M NaOH等体积中和，并在440 nm处的吸光度的测定。一个单位的蛋白溶解活性被定义为一个需要引起1 OD 440 nm增加酶量每分钟。

2.5、凝固活力

血液（12毫升）从兔耳缘静脉收集和分配到管含有0.15 M柠檬酸钠（9:1 V/V）。3000 rpm离心10 min后，超级游泳的血浆标本。活化部分凝血活酶时间（APTT）加0.75–3mu;克ohvsto 50mu;L的兔血浆中进行的，其次是50mu;L triniclot HS试剂（tcoag爱尔兰公司、爱尔兰），并分别在37°C 1分钟。最后，前50mu;L CaCl 2温暖加用止血分析仪测定时间凝（KC-1；西格玛诊断，圣路易斯，美国）。

2.6、PLA 2的纯化与分析

约10毫克的粗毒液溶解于220毫克蒸馏水。重复离心后在20000 g，5 min，200mu;L上清液注入凝胶过滤柱（Superdex 75，10 / 300 GL；GE Healthcare，德国）在AKTA FPLC系统（GE Healthcare，德国）。蛋白质与0.1米醋酸铵（PH值为6.5），在1毫升/分钟，在室温下的流速洗脱，并收集了0.5毫升的馏分收集。采用pH稳态装置测定PLA 2活性对脱氧胆酸和磷脂混合胶束（辐射计，哥本哈根，丹麦）在pH 7.4和37°C [ 18 ]。含PLA 2活动汇集，冻干，并重新溶解的组分通过反相高效液相色谱法进一步纯化。硅胶柱（多孔层实心球的C 18，4.6毫米times;250毫米，5mu;mu;m的颗粒粒径，300Aring;孔径）是平衡的溶剂洗脱（0.07% TFA），在1毫升/分钟的溶剂B逐步线argradient流量（0.07% TFA在CH 3 CN）：0–30% 5分钟，30–45% 15分钟，20分钟和45–55%收集蛋白峰经真空离心蒸发浓缩器（品牌/型号：LABCONCO，美国）进行生化分析。

2.7、Ohv PLA 2 s的顶置气门对血小板聚集的影响

血从健康成人志愿者收集和分配到管含有3.8%的柠檬酸钠（1:9 v/v血）。在1000 rpmfor10 min离心后，上清液收获超富血小板血浆（PRP）。在一个聚集仪检测血小板聚集率（佩顿模块600B，加拿大）在不断搅拌下在37°C。PRP（400mu;L）与不同浓度的纯化的解放军2或等体积PBS（对照）3分钟，前胶原中加入终浓度为5mu;克/ ml.percen确定了锡抑制（1minus;残余聚集/基线聚集）times;100%。

2.8、纯化和鉴定3ftxs和Kunitz抑制剂

大峰洗脱从Superdex 75柱3ftxs 和Kunitz型蛋白酶抑制剂。此峰汇集，一单5 / 50 GL柱离子交换层析进一步纯化冻干（GE Healthcare，德国）。第一列是平衡与50毫米MES缓冲液（pH 6）在流速为1 mL/min，进样后柱冲洗5分钟，随后在同一缓冲的NaCl线性梯度的两步：0米至0.1米和0.1米30分钟到15分钟。主要的蛋白峰的膜过滤浓缩（截留分子量3000，超滤，美国）在反相高效液相色谱法在硅胶柱进一步纯化（多孔层实心球C 18、4.6毫米250毫米times;）。第一列是平衡与85%溶剂（0.1% TFA）和15%溶剂B（0.1% TFA 80%乙腈）。洗脱（1毫升/分钟）进行了使用线性梯度的15%至50%溶剂B。

2.9、蛋白质鉴定的质谱分析和N-末端测序

纯化的蛋白质进行质谱分析的质谱仪（microTOF；Bruker Daltonics公司，不来梅，德国）。样品溶于50%（v/v）0.1%甲酸预混与5毫克/毫升的70%芥子酸基质溶液-乙腈（v/v）与定位到目标板0.1%甲酸乙腈。在某些情况下，蛋白质与Q-TOF Ultima MALDI分析（微团，曼彻斯特，英国）在学术界的核心蛋白台湾学报。蛋白质鉴定，LC-MS/MS肽测序和指纹进行。在凝胶消化测序级氨（为3ftx识别）或胰蛋白酶（毒液成分比其他3ftx）进行了先前描述的[ 18 ]。将所得的肽的一个esi-quad-tof仪器分析（水域SYNAPT G2 HDMS，曼彻斯特，英国）在采集数据的依赖性的经营模式。峰值列表文件的创建和提交的吉祥物（Server V2.2、Swiss-Prot）使用MS / MS离子搜索识别毒蛋白。搜索参数包括了两漏切”和各种侧链修饰包括carbamidomethyl（C）、氧化（M）、氧化（HW），和丙（C）25 ppm肽公差和0.05大质量公差。

以确定的N-末端序列，纯化的蛋白脱盐、真空干燥和通过自动测序仪测序（procise492；应用生物系统公司，美国）。另外，蛋白质样品进行SDS-PAGE在还原条件。电泳后，蛋白条带转移到PVDF膜与氨基黑染色（0.2% 7%乙酸），特定的蛋

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