泰国蛇类多价抗蛇毒血清（神经性多价抗蛇毒血清）交叉中和亚非眼镜蛇和亚洲金环蛇蛇毒外文翻译资料

 2023-01-10 16:16:29

泰国蛇类多价抗蛇毒血清（神经性多价抗蛇毒血清）交叉中和亚非眼镜蛇和亚洲金环蛇蛇毒

Poh Kuan Leong1, Si Mui Sim1, Shin Yee Fung2, Khomvilai Sumana3, Visith Sitprija3, Nget Hong Tan2*

1 Department of Pharmacology, Faculty of Medicine, University of Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia, 2 CENAR and Department of Molecular Medicine, Faculty of Medicine,

University of Malaya, Kuala Lumpur, Malaysia, 3 Queen Saovabha Memorial Institute, Bangkok, Thailand

摘要：

背景：毒蛇咬伤是亚洲国家的乡村地区面临的严重公共健康威胁。迄今为止，

应对毒蛇咬伤唯一行之有效的方法是抗蛇毒血清治疗。已被报道抗蛇毒血清可以交叉中和亲缘较近的不同物种蛇毒。本文通过交叉中和研究一种新型多价抗蛇毒血清，称为神经性多价抗蛇毒血清（NPAV），本次实验的NPAV是通过4条泰国眼镜蛇免疫制备的。

主要调查结果：利用小鼠进行体外中和实验表明NPAV能够有效地中和常见的来自南亚的亚洲眼镜蛇（眼镜蛇属）、眼镜王蛇、金环蛇（金环蛇属），蛇毒的致命毒性， 但只有来自印度次大陆及非洲的抗眼镜蛇毒能被适度有效弱化。一些研究表明，在几种蛇毒和NPAV体内外中和的效力是相似的。在麻醉大鼠体内，NPAV也可以完全防护N. sputatrix蛇毒引起的有氧呼吸抑制和神经肌肉阻滞效应，表明NPAV能中和眼镜蛇毒主要的致命毒素。

结论：新研制的多价抗蛇毒血清NPAV可能发现在东南亚、马来西亚及泰国的周边大陆的眼镜蛇咬伤的治疗中。然而，对于东南亚的被眼镜蛇和金环蛇咬伤者， NPAV治疗的适用性需要通过临床试验证实。实验交叉中和的结果有助于多价抗蛇毒血清的广泛应用和制备。

关键词：蛇毒； 眼镜蛇；金环蛇；多价抗蛇毒血清；

简介

每年全球毒蛇咬伤病例估计已经超过180万，有90000多人因此死亡。大多数的蛇伤病例发生在亚洲南部和东南亚（估计有720000例，53000例死亡），其次是非洲（大约420000例，32000例死亡）[ 1 ]，咬伤病例主要是眼镜蛇科和蝰科蛇类造成。在眼镜蛇科之中，眼镜蛇和金环蛇是蛇伤[ 2,3 ]的主要原因，约有7属34种（Aspidelaps, Boulengerina, Hemachatus, Naja, Ophiophagus,Pseudohaje and Walterinnesia）。眼镜蛇属广泛分布在非洲（13种）和亚洲（12种）的大部分区域[ 4 ]。扁颈眼镜蛇或俗称为眼镜王蛇，是眼镜王蛇属的唯一成员，只发现于亚洲。金环蛇属（金环蛇）有12种，其分布仅限于印度次大陆、东南亚、以及华南和台湾[ 4 ]。眼镜蛇和金环蛇蛇毒一般是具有神经毒性[5]。抗蛇毒血清是治疗毒蛇咬伤行之有效的治疗方法。单价抗蛇毒血清是从一个特定物种的毒液中制备，因此一般只在特定的物种造成的咬伤治疗中有效。由于在咬伤物种的准确诊断困难，提供非特殊保护治疗几种毒蛇咬伤的多价抗蛇毒血清已经可以在市场买到。有人认为单价抗蛇毒血清一般比多价抗蛇毒血清更有效，但这还尚未明确。目前，针对几种亚非毒蛇的多价抗蛇毒血清可以在市场上买到，主要由亚洲或非洲的商业医药企业或政府机构生产 [5,6]。然而，这些商用具有非特异保护作用的多价抗蛇毒血清缺乏严格评价。最近，泰国红十字会产生了一种新的多价抗蛇毒血清，可中和眼镜蛇咬伤产生的神经毒素。这种多价抗蛇毒血清被称为神经性多价蛇抗蛇毒血清（简称NPAV），NPAV是用来治疗4种医学上重要的泰国眼镜蛇和金环蛇咬伤，即孟加拉眼镜蛇 (Thai monocellate cobra)、 印度扁颈眼镜蛇 (king cobra)、 马来环蛇 (Malayan krait) 和金环蛇(banded krait)。在本文中，我们记录NPAV抗普通亚非洲眼镜蛇（Naja spp. and Ophiophagus hannah）和金环蛇（Bungarus spp..）的不同蛇毒交叉中和潜力评价，也比较多价抗蛇毒血清与相关的单价抗蛇毒血清的效价。实验结果将提供初步的信息多价抗蛇毒血清是否可以用于泰国以外的眼镜蛇和金环蛇咬伤治疗，以及推广泛亚多价抗蛇毒血清的应用 [ 7 ]。

材料与方法

蛇毒和抗蛇毒血清

爪哇喷毒眼镜蛇，中南半岛喷毒眼镜蛇，孟加拉眼镜蛇（泰国），菲律宾眼镜蛇，努比亚喷毒眼镜蛇，舟山眼镜蛇，眼镜蛇（斯里兰卡、样品1）、眼镜蛇（印度，样本1和2），非洲森林眼镜蛇，黑颈眼镜蛇，努比亚射毒眼镜蛇，马里眼镜蛇、埃及眼镜蛇、银环蛇和青环蛇等的蛇毒均购自 Latoxan 公司（(Valence, France）。苏门答腊眼镜蛇，孟加拉眼镜蛇（马来西亚），眼镜王蛇，马来环蛇、金环蛇和红头环蛇等的蛇毒来自几个汇集的成年个体，眼镜蛇（斯里兰卡样品2）蛇毒样品是从来自斯里兰卡的几个成年蛇类个体获取混合而成的。蛇毒提取后，立即冻干。对两种抗蛇毒血清进行了研究：（一）神经多价抗蛇毒血清（NPAV）（冻干，批号0030208；实验日期2013年4月21日），纯化的F(abrsquo;)2从抗四种混合蛇毒（孟加拉眼镜蛇（Thai monocellate cobra）眼镜王蛇（king cobra），马来环蛇（Malayan krait）、金环蛇（banded krait）的马免疫血清获取；（b）孟加拉眼镜单价抗蛇毒血清（NKMAV）（全称：眼镜蛇蛇毒血清；冻干；批号0090406；实验日期2014年8月31日），纯化的F(abrsquo;)2获得从抗泰国产的孟加拉眼镜蛇毒马免疫血清获取。这些抗蛇毒血清都是由泰国曼谷红十字会毒蛇研究所（QSMI）生产。抗蛇毒血清中和实验，两者都是以同样的方式加水稀释：生理盐水10毫升加入到1瓶冻干抗蛇毒血清。根据说明书，1 ml NPAV血清能够中和下列蛇毒的量：孟加拉眼镜蛇和金环蛇蛇毒各0.6 mg，马来环蛇0.4 mg 和0.8 mg眼镜王蛇毒液；而1 ml NKMAV血清能中和0.6 mg孟加拉眼镜蛇毒。

动物

小白鼠（ICR品系，20–25 g）和雄性SD大鼠（250–300 g）是由马来亚大学医学系实验动物中心提供。动物实验按照CIOMS所给出的指导进行[8]，所有的实验动物被马来亚大学的动物保护和利用委员会（ACUC）批准 (Ethical clearance letter No. PM/03/03/2010/FSY(R))。

蛋白质含量测定

用Bradford法测定蛋白含量[ 9 ]，每种测量都进行三次，牛血清白蛋白(Sigma，USA) 是用于生成标准曲线。

色谱和电泳分析抗蛇毒血清

利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行研究，使用Bio-Rad broad-range 预染标准的SDS-PAGE（6.5–200 kDa），在凝胶（12.5%）中加入抗蛇毒血清样品各15mu;l（3 mg/ml）。对稀释的抗蛇毒血清（100mu;l，10 mg/ ml）在Superdex 200 HR 10 / 30，13mm SEC106300mm（GE Healthcare，Sweden）下进行高效凝胶过滤色谱。洗脱缓冲液由100 mM磷酸钠，0.15 M NaCl，PH值为7.4 ，在0.75 ml/min的流速下进行洗脱。蛋白质测定的吸光度为280 nm。根据Bio-Rad (BIO-RAD Gel filtration Standard)标准条带，可知下列蛋白质标准分子量: 甲状腺球蛋白(670 kDa) 、 丙种球蛋白 c (158 kDa)、 卵清蛋白 (44 kDa) 和肌红蛋白 (17kDa)。

蛇毒致死性测定

半数致死剂量LD50的测定：通过静脉注射或肌内注射蛇毒到ICR小鼠（20–25 g，n = 4），48 h后记录ICR小鼠成活率。

致死蛇毒的体外中和

致死蛇毒的体外中和实验按照Ramos-Cerrillo的指导进行[11]。简而言之，在蛇毒加入50 mu;l生理盐水混合后，与不同水稀释度的抗蛇毒血清（NPAV 或NKMAV）在37 ℃预孵育30 min，它们总体积的量是250 mu;l，混匀后10000 g离心，之后注射到小鼠静脉。记录48 h后存活数量。一般来说，使用的剂量为5倍LD50。然而，注射200 mu;l的加水稀释血清（小鼠最大允许注射量）未能完全保护小鼠，所以将注射剂量改为2.5倍LD50。当动物被注射孵育的混合物(containing 2.5 LD50 challenge venom in 50mu;l saline and 200mu;l of the undiluted reconstituted antivenom)后全部死亡，那么血清是无效的。中和血清效价表示为ED50 (the amount of reconstituted antivenom in mu;l or the ratio of mg venom/mL reconstituted antivenom that gives 50% survival of the animals tested)，按照Morais等[12]计算中和效价(P, the amount of venom that is completely neutralized by a unit volume of antivenom)。

致死蛇毒的体内中和

对小鼠（n = 4）进行肌肉注射5倍或2.5倍LD50蛇毒，10分钟后，静脉注射适当稀释的抗蛇毒血清200mu;l，记录48 h后的存活数量。

抗爪哇喷毒眼镜蛇血清在蛇毒诱导的心血管抑制和神经肌肉阻断作用时对大鼠的保护作用对三组大鼠（n = 3，250–300 g）进行腹腔麻醉注射（1.4g/kg，i.p.）后，其眼睑反射和蹬腿反射消失。动物麻醉后准备手术，同时测量血压、心跳率、呼吸频率和肌肉收缩的张力。实验数据使用 PowerLab 4 / 30数据采集系统的LabChart软件的进行收集分析（ADInstruments, Australia）。第1组大鼠（termedlsquo;saline/-rsquo; group)）肌内注射生理盐水50 mu;l作为0 时间点和起始对照组；第2组( termed lsquo;NsV/-rsquo;Group）大鼠以6 mg/kg 的量肌内注射爪哇喷毒眼镜蛇毒 （dissolved in 50 mu;l saline）；第3组大鼠（termed lsquo;NsV/NPAVrsquo; group）以相同的剂量注射蛇毒，然后静脉注射 3 ml NPAV（1 mL each at 10 min, 30 min and 50 min post-injection of the venom）。抗蛇毒血清注射时间点要选择在没有血压、心率和呼吸率干扰下进行。

统计分析

蛇毒的LD50和抗蛇毒血清的ED50是表示为95%的置信区间(C.I.)。LD50、ED50（median effective dose）和95%置信区间（C.I.）使用Finney[ 13 ]概率分析方法和2009生物统计学分析软件计算（AnalystSoft Inc.），药理研究的统计分析使用SPSS进行。数据（expressed as mean 6 S.D.）均采用单因素方差分析，Tukeyrsquo;s post hoc 多重比较检验， P,0.05 为显著。

结果

抗蛇毒血清成分

NPAV和NKMAV的蛋白质含量分别为20.3 mg/mL 和12.5 mg/mL。NPAV（Neuro Polyvalent Snake Antivenom）和NKMAV（Naja kaouthia monovalent antivenom）的SDS-PAGE电泳样品没有发现明显的过高或低分子量的蛋白质条带（Fig. 1），在这两种抗蛇毒血清凝胶过滤色谱图中也是同样的结果（Fig.2）。基于曲线下面积的比较， F(abrsquo;)2的量在抗蛇毒血清是可比的（91–96%），在NKMAV二聚体和低分子蛋白质的量都均略高于NPAV（Figure 2）。在这两种抗蛇毒血清中没有检测到大分子聚集体。

抗蛇毒血清在体外中和蛇毒的致死效应

NPAV和单价抗孟加拉眼镜蛇毒血清（only for selected venoms）在体外中和蛇毒致死性的结果分别显示在表1和表2。结果表明，NPAV在所有金环蛇以及几乎所有的亚非眼镜蛇毒研究（except for the African spitting cobra N. katiensis）中能够提供保护和交叉保护，尽管中和效力范围有从低到高的波动。NKMAV 能中和试验中的六亚洲眼镜蛇毒液（N. kaouthia [Thailand amp; Malaysia], N. sputatrix, N. sumatrana, N. siamensis and O. hannah），其治疗效果和NPAV一样，但未能中和金环蛇和马来环蛇蛇毒，有趣的是，NPAV中和孟加拉

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