超级根衍生的由发根农杆菌介导转化的百脉根植物，是一个对于基因组学研究的有价值的工具外文翻译资料

 2023-01-10 16:16:39

超级根衍生的由发根农杆菌介导转化的百脉根植物，是一个对于基因组学研究的有价值的工具

Bo Jian, Wensheng Hou, Cunxiang Wu, Bin Liu,Wei Liu,Shikui Song, Yurong Bi and Tianfu Han

摘要

背景：转基因方法为植物基因功能的研究提供了强有力的工具。然而，一些豆类植物仍然顽固的变换技术，限制了本该在任何程度上可以执行的功能基因组学研究。百脉根超级根，是一个直接由体细胞胚胎发育和植株再生的连续根克隆系统。最近，有一种通过农杆菌介导的超级根源叶，从中获得转基因百脉根植物的技术。然而，转化效率很低，基因转移到聚合酶链反应鉴定中大约需要六个月的时间。

结果：在本研究中，我们开发了一个研究超级根变换的发根农杆菌介导的衍生百脉根基因功能，结合高效的发根农杆菌介导的转化和超级根快速再生系统。

利用发根农杆菌K599 载体pGFPGUSPlus转换系统通过验证一些参数，可能会影响转化率提高。一个节点利用茎段为外植体，进行为期2天的预培养的外植体，在OD600 = 0.6 K599感染和共培养介质（pH 5.4）在22°C下， 2天便明显提高了转化频率。作为概念验证，超级根衍生百脉转化与来自小麦编码的Na / H 的基因逆向转运（TaNHX2）使用所描述的系统。从TaNHX2的表现如预期，获得转基因植株超级根和增加了耐盐性。

结论：这种快速高效的工具广泛地应用于在百脉基因功能研究，结合超级根再生系统的简单性和高效率，并可用于发根农杆菌介导的转化。基于GUS的一些参数检测达到92％，该系统通过验证改进了影响转化频率的问题。高效转化和再生系统组合的超级根，提供了在百脉功能基因组学研究的宝贵工具。

背景：

豆类作物在为人类消费和动物年龄提供油和蛋白质有着重要的经济意义，同时也是全球氮循环的主要贡献者, 由于他们独特的共生固氮的能力。除了他们在农业方面的重要性,豆类还生产各种有益次生化合物,其中许多已被证明有促进健康提供预防人类疾病等属性。

植物转化是分子分析基因功能的有用工具，和有限的转换功能在我们进一步理解基因功能方面构成障碍。在豆类中转换选择测试基因功能的方法。然而,许多人仍在种植谷物豆类时，顽固的采用电流转换技术或低转换频率限制其潜在作为对象进行基因功能研究。

发根农杆菌，一种土壤细菌，在不够良好的条件下也能使毛状根生长。它在从Ri质粒的T-DNA转化为植物基因组和T-DNA的二进制向量时，使外源基因的整合。多毛状根部有在外源植物生长调节剂的情况下在体外生长的独特性。这些生长特性及发根农杆菌的转化频率提高了生产复合植物在体外和体外工具测试根系生物学基因的功能。然而，它不评估基因功能在整株水平上非转化芽的部分。另外，不是所有的毛根都是共转化，这使得分析变得复杂。

百脉根是多年生植物，细茎，豆科植物，有具有提高农业牧草和干草作物产量的作用，在近几年来也变得重要起来。它已成为一个主要的作物，在温带牧草产区的世界取代白色三叶草和紫花苜蓿的潜力，由于其营养价值高，其不良环境条件的耐受性。长期铁离子独特的体外培养体系是在豆科植物百脉根中体现。该系统可连续克隆根，直接体细胞胚胎发生和植株再生质量无外源植物生长调节剂。然而，直接转换成铁离子吸收是不成功的，从而限制了它的使用。最近，转基因百脉根是超级根通过农杆菌介导转化获得的。然而，转化效率较低，观察在仅仅56叶段削减919段移后50天间的愈伤组织，并从基因PCR鉴定过程花了六个月。因此，在农杆菌介导的转化超级根源频率和效率仍作为广泛使用的一个障碍。

在本研究中，我们开发了一个高效的发根农杆菌介导的超级根衍生百脉根转化，开发高效的发根农杆菌介导的组合，及超级根快速、简单的再生系统。该系统可用于在整株水平上研究基因的功能。改进后的转化是通过优化影响转化效率的参数来实现，如外植体类型[15,16]和pH值对共培养基（CCM）。为了进一步验证该系统基因功能分析，从小麦编码Na /H 逆向转运蛋白，在植物耐盐中起着重要作用的基因，将其引入百脉根的超级根和再生植株的耐盐性评价。

结果：

从发根的发根农杆菌诱导超级根高效获得转基因植物

在MS培养基中培养前后，外植体感染发根农杆菌然后放在坚实的CCM。将外植体放置在1/2 MS培养基共培养后诱导毛状根。七天后，在受伤部位开始出现发根。当发根长至3的长度至4厘米，每个单独的毛状根被用数字标记，也可以用于GFP和GUS检测，从各发根切割约1厘米长的段。因此鉴定为GUS和GFP阳性的发根，然后从原始外植体切下，并转移到再生培养基（RM）。几乎100％的再生进枝芽或苗在25天后发根。茎叶芽转移到无任何植物生长调节剂的MS培养基，对于伸长和生根起作用。转基因百脉植物获得约两个半月，并再生植株具有典型的硬根型短节间和皱叶。

转毛根和再生植株的分子生物学特性研究

被确定为转基因的毛状根经格斯染色和GFP检测被转移至芽的诱导。对再生植株进行扩增，分别设计引物扩增格斯和绿色荧光蛋白片段。

PCR结果显示GUS和GFP的存在相应的转基因样品和缺席在阴性对照中的预期大小（750和641碱基对，分别）的条带，这表明所有的阳性转基因发根衍生的植物含有两个GFP和GUS基因。Southern印迹分析也进行了识别，转基因事件。再生植物的基因组DNA用HindIII消化而切在T-DNA中的单个位点。限制性消化的DNA然后臃肿和杂交一个750 bp的地高辛（DIG） - 标记的GUS片段作为探针。如图2E，六随机选择的再生植物显示在T-DNA的一个不同的单一整合事件，从而证实它们的独立转基因的性质。没有杂交信号中观察到的对照植物。

为了进一步验证的基因转移，GFP和GUS表达在整株水平进行监测。在对比“复合植物的，其中仅根转化，从发根再生的植株整个显示GUS染色（图2C和2D）和GFP荧光（图3D）。转化事件进行了另外通过Western印迹使用抗GFP抗体证实。如图3F所示，Western印迹表明GFP在随机的存在下选择7个独立的转基因植物具有约27 kDa的带，并在对照植物中没有检测到信号。

一个节点的茎段是最适合进行改造的外植体

不同类型的外植体可能有不同的能力，以发根农杆菌感染。在目前的研究中，根，叶，节间和茎与一个节点部分作为外植体，以确定哪种类型的外植体为最适合于超级根百脉发根农杆菌介导的转化。在方法中描述的标准步骤，用于此目的的预培养物的持续时间为一天，外植体是唯一可变的性质。如图4所示，变换频率变化与外植体类型。最高转化频率（74.64％），当茎段与一个节点作为外植体获得。与此相反，根作为外植体时转化频率只是14.49％。得到具有茎段与一个节点作为外植体的转化率为显著不同（Fisher的最小显着差异（LSD）检验，P lt;0.05），以所有其它类型的外植体的试验。显然，与一个节点的轴部是最合适的外植体的发根农杆菌介导的转化百脉品种。超级根，它被用来测试对转化频率等参数的影响。

预培养时间对转化频率的影响

最近的报告表明，预培养可以影响转化频率[15,17,21]。在感染前用发根农杆菌，茎段用一个节点预培养在MS培养基为一个变周期从0至6天，之后进行了方法的标准程序是用于检测的剩余部分。

转化频率取决于预培养真正的时间如图5所示。结果表明，1至3天的预培养后的转化频率可以提高。最高转化频率（91.67％）是一个预培养在2天后观察到的，它是从其它预培养持续时间（P lt;0.05）显示不同。具有扩展的预培养时间转化频率下降，以致使转化频率的至51.11％的下降了6天的预培养。因此，为期2天的预培养是用来测试对转化频率以下参数的影响。

发根农杆菌的细胞密度转化频率的影响

发根农杆菌的生长状况可能影响其毒力，并由此转化频率。为了评估它，茎段有一个节点，其中预培养两天，感染了不同密度农杆菌培养分别对应于OD 600= 0.2，0.4，0.6，0.8和1.0。随后被视为标准过程中的方法。最高转化频率（89.64％），当发根农杆菌培养物在晚对数阶段被使用，得到对应于OD 600= 0.6。在这个OD600，转化频率显著升高（Plt;0.05），超过其他所有测试的细胞浓度（图6）。

共培养条件对转化频率的影响

感染病毒后，外植体放置在CCM允许从质粒的T-DNA转移到植物细胞。有关共同培养的几个参数进行了测试，以评估其对转化频率的影响。对于共培养持续时间，所述茎段与一个节点进行了为期两天的预培养，感染了发根农杆菌对应于OD600约为0.6，然后置于CCM（pH5.4）在24℃下为1，2，3或4个天。在此之后，将外植体放置在1/2 MS培养基进行发根的培养。如图7A所示，最高转化频率（91.54％），用2天共培养来实现。短期和长时期共培养的转化率都较低。为了测试CCM的pH值的影响，正如上文方法的标准过程，只是将CCM的pH值在5.0，5.2，5.4，5.6，5.8和6.0的测试。5.4 ACCM pH值被认为是最佳的，这导致转化率为86.15％。低于或高于5.4导致转化频率的降低pH值的CCM，最低为10.31％，pH为6.0（图7B）。生长温度影响许多致病菌的毒性作用。要在对共培养测定温度的影响转化频率，标准的步骤，除了用20℃，22℃，24℃，26℃，28℃和30℃，在共培育温度进行了测试。结果发现，22°C为最适温度为共培养，转化率是93.59％（图7C）。转化频率显着的增加温度下降，当温度分别为28℃和30℃时，转化率下降到52.84％和28.93％。

在植物的再生中潮霉素可以作为一种有效的选择标记

对再生植株的潮霉素的影响也进行了评估。如图8所示，再生频率与潮霉素浓度的增加与下降情况。所有的根可以分化成芽，在RM无潮霉素和转基因阴性对照根之间无显著性差异（图8A）。当溶液中加入2毫克/升潮霉素，100％转基因根与仍有约70％的分化的负的转基因根部（图8B）。当4毫克/升潮霉素为加入到RM，所有阴性对照根死亡。然而，约80％的转基因根仍然能够分化（图8C）。很少有转基因根成活，分化成茎叶芽时6毫克/升潮霉素加入到RM（图8D）。因为当4毫克/升潮霉素时，所有的阴性对照根死亡，且所有再生植株均呈GUS阳性，可以得出的结论是4毫克/升潮霉素是有效的植物再生过程中选择转基因植物。除此之外，该测定表明，潮霉素可直接使用，用于选择转基因毛根不用事先进行GFP或GUS检测。

基因功能测试系统的验证

为了验证本研究开发的基因功能的调查制度，构建pCMTaNHX2（图9A，下图）。使用获得的转基因毛状根茎段有一个节点作为外植体，为期2天的预培养，感染发根农杆菌的OD 600= 0.6，上的CCM共培养（pH为5.4）在22℃下进行2天。当使用这些参数优化，转化频率能达到92％。转基因百脉植物两个半月即可获得（图10）。进行Southern印迹分析，以确定转基因事件。再生植物的基因组DNA消化用EcoR I在T-DNA内切割一次。限制性消化的DNA，然后吸印和杂交一个728 bp的DIG标记的tanh X 2片段作为探针。如图9B所示，六个随机选择的转基因植株显示TaNHX2基因，从而证实它们的转基因性质的单一的整合事件。没有杂交信号中观察到的对照植物。再生小植株的GUS染色，与图9C所示的例子中，确认了双元载体的T-DNA整合到植物基因组和GUS表达。没有观察到GUS表达在对照植物。四个独立的转基因株系被随机选择，TaNHX2的表达水平通过逆转录PCR（RT-PCR）进行监测。beta;-微管蛋白（AY633708）用作参考基因。正如预期的那样，转基因TaNHX2线1-4表示TaNHX2，而没有表达在对照植物（图9D）。为了迅速获得大量的转基因植物TaNHX2的耐盐性试验中，小植株从个体毛状再生根切成茎段与一个或两个节点

然后插入到MS培养基中生根。经过10-13天，90％部分产生的根源。为了测试转基因植物超级根过表达TaNHX2的耐盐性，每一个独立的转基因百脉根线与阴性对照十植株使用。一个例子示于图9E中，控制植物生长

在MS介质15天（pH值5.8）含有150毫氯化钠漂白，根系发育不良和植株在其成长被阻。相反，转基因超级根植物过表达TaNHX2存活并使它健康成长。

讨论

转基因植物生产研究门控基因功能是有用的。功能基因组学研究的进展在不断地增加对于豆类高效转化系统的需求。一个有效的遗传转化技术的发展将促进百脉根和转基因超级根系统的生理和分子生物学研究，在植物表达工厂上也起到帮助。高频生产转基因植物的依赖于从土壤杆菌的高效的T-DNA递送到植物细胞中，选择转基因细胞和植物再生。在本研究中，发根农杆菌K599的载体pGFPGUSPlus用于优化超级根衍生百脉植物转化。载体pGFPGUSPlus是具有两个报告基因，GFP和GUS，在一个有效的转化载体中，简化了对于传输事件的识别。潮霉素，是一种有效的选择剂用于植物转化，具有被证明是有效的植物再生过程中，也是本研究中选择的阳性转基因植株。事实上，只转基因根在能够分化成幼芽和大多数转基因根产生小植株时4毫克/升潮霉素加入到RM，如图8。由于所有能够再生这一选择培养基试管苗表达GUS和GFP，我们建议，潮霉素在被选择用于正转基因植物的情况下，可直接使用GFP或GUS检测。这种直接选择潮霉素的方法既节省时间,又减少污染。

简易和高效的超级根再生选择系统使用载体pGFPGUSPlus，作为T-DNA传递农杆菌和植物细胞转基因超级根工厂生产的关键环节。T-DNA递送是从土壤杆菌到植物细胞，是由许多参数构成的一个复杂的过程，如土壤杆菌的影响品系,预培养持续时间,外植体类型,温度和共培养时间。很明显，并不是所有的细菌具有毒力给宿主植物细

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