结构-seq2:体内RNA结构的灵敏和准确的全基因组图谱外文翻译资料

 2023-03-28 13:02:57

结构-seq2:体内RNA结构的灵敏和准确的全基因组图谱

作者：Laura E. Ritchey1,2,dagger;, Zhao Su3,dagger;, Yin Tang4, David C. Tack3, Sarah M. Assmann3,* and Philip C. Bevilacqua1,2,5,*

单位：1Department of Chemistry, Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA, 2Center for RNA Molecular Biology, Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA, 3Department of Biology, Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA, 4Bioinformatics and Genomics Graduate Program, Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA and 5Department of Biochemistry amp; Molecular Biology, Pennsylvania State University, University Park, PA 16802, USA

摘要：RNA在生物学中具有许多功能，如剪接、温度传感和先天免疫。这些功能往往是由RNA的结构决定的。因此，了解RNA结构及其在体内和全基因组不同生物过程中的变化迫在眉睫。这里，我们提出结构-seq2，它在活体和全基因组范围内提供核苷酸分辨率的RNA结构信息。我们最初的结构-序列方法的优化版本将灵敏度提高了至少4倍，并通过最大限度地减少有害副产物的形成、减少连接偏差和提高读数覆盖率来提高数据质量。我们还提出了一种结构-序列2的变体，其中一个生物素化的核苷酸在逆转录过程中被融合，这通过消除两个PAGE纯化步骤极大促进了实验进行。我们以水稻的mRNA和rRNA结构为标准标定结构-序列2。我们证明了结构-序列2可以带来新的生物学见解。我们的结构-序列2数据集揭示了叶绿体rRNA中隐藏的断裂，并在核编码的水稻rRNA中鉴定了一个以前未报道的N-甲基腺苷酸。总的来说，结构-seq2是一种快速、灵敏、无偏差的体内和全基因组RNA探针方法，有助于对RNA生物学的新见解。

引言

RNA结构影响许多生物过程[1]，其中许多可以通过一个总RNA结构得知，因此关于RNA结构的全基因组信息是非常有价值的。高通量方法为经典的一次性基因特异性、典型的基于凝胶的RNA结构研究方法提供了高效、经济的替代方案。最近，已经开发了几种高通量的RNA结构方法[1–4]。在这些方法中，我们开发的结构-序列方法[5,6]在实验和计算研发中具有一些优势。最重要的是，因为结构-序列依赖于化学修饰而不是核酸酶切割，所以它可以在体内进行，这一点很重要，因为体内和体外结构往往不同[7]。结构-序列的实验方法比其他方案具有优势，因为逆转录在RNA纯化后立即进行，以最大限度地减少RNA降解。结构-序列还提供了一个强大的、用户友好的计算通路，叫做Structure Fold [8]。

在我们最初的结构-序列方法[6]中，我们用硫酸二甲酯(DMS)在体内探测RNA，硫酸二甲酯共价修饰未受保护的腺嘌呤和胞嘧啶。在RNA提取和RNA富集后，用随机的含六聚体的引物进行逆转录(RT)，其在修饰核苷酸之前的核苷酸处停止。

衔接子连接到基因3`末端后，产物进行聚合酶链反应扩增和测序。从正二甲基硫样品中减去负二甲基硫样品的逆转录终止信号，并计算反应性，其可用作预测全基因组RNA结构的限制[9]。虽然结构-序列功能强大，但我们确定了可以改进的步骤。在这里，我们描述了结构-序列2(图1，补充图S1)，并使用一个新的物种-水稻证明了它的适用性。在结构-序列2中，所需的起始材料的量从2000ng减少到300-500ng poly(A)-selected RNA，使用不同的连接方法以及采用了两块额外的变性PAGE胶（图1）。 为了规避这些凝胶的时间要求和成本，我们还开发了一种变体，在逆转录过程中使用生物素化dCTP链霉亲和素下拉法，简化了方案。

图1|结构-序列2的两个版本产生高质量的数据

在结构-序列2中，RNA (Kelly green)首先被DMS或另一种可以通过反转录读出的化学物质修饰。然后，通过转化成cDNA(步骤1A/1B，蓝色)，连接衔接子(步骤3A/3B)，并在掺入TruSeq引物序列的同时扩增产物(步骤5A/5B)，制备用于Illumina NGS测序的RNA。为了提高库的质量，对原始的结构-序列方案(盒装)进行了大量的改进。改进包括用发夹接头和T4DNA连接酶进行连接(步骤3A/3B；粉红色)[10]，并加入各种纯化步骤以除去有害的副产物(图2A)。我们提出了两种纯化方法:聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化(A)或生物素-链霉亲和素下拉(B)。在聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化方法中，在反转录后加入额外的聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化步骤(步骤2A)。在生物素-链霉亲和素下拉法中，生物素化的dNTPs(青色)在逆转录过程中被掺入延伸的产物中(步骤1B)，并在逆转录(步骤2B)和连接(步骤4B)后通过链霉亲和素磁珠下拉进行纯化。扩增后还有一个常见的最终聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化步骤(步骤5A/5B)。最后，在测序(步骤7A/7B)过程中使用定制测序引物(浅绿色)，以进一步提供高质量的数据。补充图S1是这个图的一个版本，所有的核苷酸都被明确显示。

图2.结构-序列2导致较低的连接偏差。

(A)逆转录后(图1，1A/1B步骤)，溶液中仍有过量的27 nt引物(蓝色，顶部，右侧)。在连接过程中(图1，步骤3A/3B)，该引物也可以连接到40 nt发夹接头(粉红色)，形成不需要的67 nt副产物，该副产物没有插入片段，因此导致测序读数无效。

（B）测序过程中，衔接子序列读取后的第一个核苷酸的互补序列是连接到衔接子上的核苷酸。与以前基于环连接酶的方法(蓝色)相比，我们新的基于T4DNA连接酶的方法(绿色，–DMS和粉色， DMS)大大降低了连接偏差。四个核苷酸转录组分布的百分比(黑色)是理想的。

图3|结构-序列2在25S rRNA中鉴定了一个以前未报道的m1A

A使用原始的结构序列法进行逆转录变性(65℃，不含单价盐)，有些区域不被读取(用箭头表示)。

B增加变性条件(90℃和单价盐)这些区域得以被读取(用颜色匹配的箭头表示)，并使低读取深度的区域变窄。图a和图b中的总读数相似。25S中单个区域下游读数大幅度下降的位置(红色箭头)对应于已知酵母、人类和红毛癣菌中含有m1A的位点(C，补充图S13) [16,18]。读数持续下降，直到在核苷酸539处归零。核苷酸432和644之间的区域富含79%的气相色谱，每个核苷酸的读取深度lt; 100。

D该站点对应于–DMS数据中精确位置的高逆转录停止计数。

图4|结构-序列2表明叶绿体rRNA中存在两个隐藏的断裂。

在已知叶绿体rRNA隐藏断裂的两个位置，为DMS逆转录停止计数数据峰值。第一个隐藏断裂处的峰值与菠菜和拟南芥[21，28]中公开的断裂位点相差一个核苷酸，这可能是由于物种之间的轻微序列变异引起的。（拟南芥：5`-GGGAGUGAAA*UAGAACA-3`；水稻：5`-GGGUAGUGAAAU*AGAACG-3`，其中*指推测的断裂位点）第二个隐藏断裂处的峰值恰好出现在菠菜和拟南芥[21,28]公开的分裂位点。

材料和方法

植物生长

本研究使用野生型水稻(O. sativa ssp. japonica cv. Nipponbare)。水稻种子播种在培养皿中的湿滤纸上，在温室中以16小时/8小时的昼夜光周期发芽。光强是500ｕmol/m2·s，白天温度为28–32摄氏度，夜间温度为25–28摄氏度。4–5天后，将水稻幼苗转移到6 times; 6的带水饱和土壤的苗圃中(Metro Mix 360 growing medium, Sun Gro Horticulture, Bellevue, W A, USA)。每盆种植五种植物。转移到花盆后一周，植物再浇水一次。两周龄植株的茎组织用于体内DMS探测。

体内DMS处理

所有涉及二甲基硫的实验都是在双层手套和化学通风橱中进行的。所有与二甲基硫接触的一次性物品都作为危险废物处理。

将水稻嫩芽(总共1 g)从土壤线上切下，浸入50 ml Falcon离心管中的20 ml DMS反应缓冲液(100 mM KCl、40 mM HEPES (pH 7.5)和0.5 mM氯化镁)中。对于DMS处理，向溶液中加入150ｕl DMS(最终浓度0.75%或约为75mM)，并使D M S反应进行10分钟，同时进行间歇转化和混合。为了淬灭反应，向溶液中加入1.5g DTT(最终浓度为0.5 M)。剧烈涡旋2分钟。从离心管中倒出溶液，加入50毫升蒸馏去离子水洗涤样品。洗涤步骤重复一次，然后将材料拍干并立即在液氮中冷冻。对照处理(–DMS)如所述进行，但不添加DMS。

RNA提取和纯化

所有的RNA提取步骤都是在化学通风橱中进行的，通风橱具有强气流(gt; 250 fpm)。总核糖核酸是按照制造商的方案使用核蛋白核糖核酸植物试剂盒（Macherey-Nagel, Germany)提取的。对于每个文库，500微克总RNA构成了使用聚腺苷酸纯化试剂盒(Thermo Fisher Scientific)进行一轮聚腺苷酸选择的起始材料。为了从基因中获得更多的读数，可以包括一轮额外的聚腺苷酸选择（poly(A) selection）。

文库构建

我们准备了15个不同的文库来确定对原始结构-序列方法的各种修改的结果。S1补充表格强调了这些变化。结构-序列2-/ DMS各有两个生物复制，分别为没有生物素变异(文库1-4)和有生物素变异(文库6-9)。其他每个库都将实验方案的一个步骤(图1)转换回在结构-序列[5,6]的原始版本中执行的步骤。

反转录

对于每个样品，两个20ｕl逆转录(图1，1A步骤)反应在两个独立的试管中进行，每个试管含有250ng(总量的一半)的聚腺苷酸选择的核糖核酸。为了提高引物退火的覆盖率，对SuperScript III First-Strand Synthesis试剂盒(Invitrogen)的变性和退火步骤进行了调整。也就是说，在结构seq2样品中，与Illumina TruSeq适配器、10times; RT缓冲液和dNTP混合物融合的随机六聚体的mRNA在90℃变性1分钟，然后在冰上冷却1分钟，然后加入氯化镁和DTT，最终浓度分别为5毫摩尔。然后将样品预热至55℃1分钟，加入SuperScript III，反应进行50分钟。每个反应含有250 ng poly(A) RNA，5ｕM RT引物，20mM Tris–HCl(pH8.4)，50 mM KCl，0.5 mM dNTP(每种)，5 mM氯化镁，5 mM DTT和200 U SuperScript III。加热至85℃持续5分钟终止反应。通过加入5 U RNase H并在37℃孵育20分钟来切割残留的核糖核酸。文库12使用来自原始结构-序列方法的逆转录变性条件；将核糖核酸和脱氧核糖核酸混合物在65℃变性5分钟，然后在冰上冷却1分钟，然后加入10倍逆转录缓冲液、氯化镁和DTT至与结构-序列 2相同的最终浓度。文库13测试了原始结构-序列方法的逆转录反应温度，其中逆转录反应在50℃而不是55℃进行，以监测逆转录过程中的突变率。对于结构-序列2(文库6-9)和文库5的生物素变异，文库5是仅检测生物素添加的对照文库(没有链霉亲和素纯化)，除了biotin-16-aminoallyl-2`-deoxycytidine-5`-triphosphate掺入反应混合物外，按照结构-序列2进行逆转录。(图1，1B步骤)。最后的反应包含20毫摩尔Tris-HCl(pH8.0)、50毫摩尔KCl、5%DMSO、0.5毫摩尔d-NTP（每种)、0.125毫摩尔生物素-dCTP、5毫摩尔氯化镁、5毫摩尔DTT和200 U SuperScript III。

PAGE纯化

将每个样品的两个独立反应管合并用于所有样品，并在含有10%丙烯酰胺和8.3 M尿素的变性聚丙烯酰胺凝胶上分级。根据Gene Ruler Low Range size ladder(ThermoFisher)，将约为50核苷酸大小的产物割胶回收，避免过量的逆转录引物（27nt）（图1，步骤2A）。将切下的凝胶块放入50毫升Falcon流式管中，粉碎成细块，称重。用至少两倍于凝胶块质量(克)的体积(毫升)浸泡凝胶块。然后将试管放在37℃的摇床/培养箱中过夜。乙醇沉淀首先使用0.2ｕm注射器过滤器(PALL Scientific)去除凝胶碎片，然后将缓冲液吸入到一个新的Falcon流式管中，然后加入2.5–3倍体积的100%冰冷乙醇和0.5ｕl的GlycoBlue ，将流式管放在干冰上至少1小时。样品以

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