高通量测序用于葡萄病毒诊断的质量评估和验证外文翻译资料

 2023-03-28 14:58:39

高通量测序用于葡萄病毒诊断的质量评估和验证

原文作者：Nourolah Soltani1,dagger;, Kristian A. Stevens2,3,4,dagger;, Vicki Klaassen2, Min-Sook Hwang2, Deborah A. Golino1 and Maher Al Rwahnih 1,*

单位：Department of Plant Pathology, University of California-Davis, Davis, CA 95616, USA (N.S.) (D.A.G.); Foundation Plant Services, University of California-Davis, Davis, CA 95616, USA (K.A.S.) (V.K.) (M.-S.H.); Department of Computer Science, University of California-Davis, Davis, CA 95616, USA; Department of Evolution and Ecology, University of California-Davis, Davis, CA 95616, USA

摘要：高通量测序技术（HTS）的发展，也被称为下一代测序技术，彻底改变了植物病毒的诊断研究。HTS在数据吞吐量、成本、可扩展性以及新型和高度变异病毒种类的检测方面都优于用于筛选国内和检疫葡萄材料的生物测定和分子诊断测定。然而，在基于HTS的检测用于常规的植物病毒诊断之前，需要制定和评估性能规范。在本研究中，我们选择了18株受病毒感染的葡萄藤作为测试组，用于测量基于HTS的诊断分析的性能特征。从单个样品的叶柄和休眠茎中提取总核酸（TNA），并使用75bp单端读取平台在Illumina NextSeq 500仪器上运行构建的文库。在264种不同的病毒和类病毒感染中，测得的灵敏度为98%，错误发现率（FDR）约为1/5的阳性。结果还表明，结合春叶柄试验和秋藤试验，可将TNA的HTS检测灵敏度提高到100%。为了评估提取方法，将这些结果与提取的dsRNA进行了比较。此外，在一项更详细的稀释研究中，此处描述的TNA HTS检测在稀释到5%时表现良好。在这个范围内，灵敏度为98%，对应的FDR约为1/5。可重复性和再现性分别为99%和93%。此处描述的协议、标准和性能水平可能有助于在植物检疫或认证程序的质量保证和认证目的中实现HTS的标准化。

关键词：高通量测序；葡萄病毒；验证；性能评估；灵敏度；特异性；再现性；重复性

  1. 介绍

葡萄（Vitis vinifera）是多种病原体的宿主，包括86种以上的病毒[1]，这些病毒很容易通过载体和繁殖材料在葡萄藤之间传播。病毒感染造成的经济损失对葡萄产业、苗圃和种植者产生了负面影响。例如，在加利福尼亚州，葡萄卷叶病相关病毒3（GLRaV-3）作为葡萄卷叶病的主要病毒，估计每年造成的经济损失超过 9000 万美元[2,3]。在一个葡萄园预计25年的生命周期内，葡萄红斑病还会造成每公顷超过69500美元的损失[4,5]。特殊作物（包括葡萄）可持续生产的基石是认证计划，如加州葡萄注册与认证（Ramp;C）计划。该计划旨在消灭通过嫁接/繁殖传播的特定葡萄病毒。它由加州食品和农业部（CDFA）和植物服务基金会（FPS）管理，后者是全国公认的最大的提供植物进口、检疫服务、病毒检测和病毒消除的项目。预定要进入CDFA Ramp;C计划的葡萄将使用CDFA法规中规定的方法进行检测，或从已经检测过的来源繁殖。这些方法包括草本和木本索引（生物测定）以及分子检测方法，例如聚合酶链式反应（PCR）。使用木质和草本指示剂的生物测定一直是葡萄认证项目的黄金标准方法[6]，但这些方法有几个缺点。由于气候变暖[7] 和某些病毒变种的感染[8,9]，指示植物可能会出现无症状反应。此外，芽嫁接失败可显著减少嫁接后接种的指标数量。最后，根据木质指数筛选植物材料需要2 - 3年的时间，这大大延迟了为苗圃和种植者提供种质资源的时间[8,10-12]。

传统的分子检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和PCR灵敏度较好，但需要了解目标病原体，因此在检测未知或新的病原体时并不那么有效。此外，它们的高特异性会导致对高遗传多样性病毒的假阴性检测结果[8,10]。

高通量测序（HTS），也被称为下一代测序（NGS），目前广泛应用于几乎所有的植物病毒检测领域。事实证明，HTS非特异性靶向所有核酸类型，而无需了解靶向病毒的背景知识[13-15]。HTS还有助于检测已知病毒、发现新病毒以及与未知病因相关的病毒[13,14,16-21]。HTS的检测能力与环境条件、病毒遗传变异和宿主反应无关[8]。已有文献证明，基于HTS的检测方法在灵敏度、特异性、可重复性和再现性方面至少与传统的生物学和分子方法相当，但在可扩展性、数据吞吐量、成本、灵敏度和对新型及变异菌株的特异性方面却有所超越[8,10,22]。HTS是筛选植物材料中多种病毒最快、最经济的方法，周转时间仅为几周或几个月[8,15,22]。因此，基于HTS的诊断技术将筛选繁殖材料的时间从2 - 3年缩短到9 - 12个月。缩短筛选时间可使种植材料提前繁殖，并大大缩短最终释放经病毒检测的材料所需的时间[10]。然而，由于缺乏认证机构要求的验证标准，HTS目前还未用于认证程序。

在开发基于HTS的植物认证协议时存在着特别的挑战，包括：（1）植物组织样本的类型；（2）病毒基因组RNA或DNA；（3）由于宿主和环境因素而引起的病毒效价的变化，以及（4）需要控制可能的化验失败。

在本研究中，我们使用了检测灵敏度、特异性、重复性和再现性的分子分析验证性能标准[23]来研究一种基于HTS的协议检测葡萄病毒的性能。采用春叶柄和秋藤两种采样方法，TNA和dsRNA两种提取方法。以菜豆黑龟豆（BTS）为阳性对照，研究了菜豆内病毒1（PvEV-1）和2 （PvEV-2）的感染情况。此处描述的协议、标准和性能水平可能有助于在植物检疫或认证程序的质量保证和认证目的中实现HTS的标准化。

  1. 材料和方法
    1. 植物

本研究中使用的18个受感染的葡萄藤节段（表1）保存在戴维斯病毒（Davis Virus）采集库中[8,24]，并被FPS用作病毒阳性对照[25]。选择这18株葡萄是因为它们感染了广泛的常见DNA和RNA病毒和类病毒。葡萄藤保持在田间条件下，就像许多用于诊断的样品一样，额外一株藤蔓（cv.lsquo;Ganzinrsquo;）作为健康对照组。这株葡萄藤来自一个FPS认证的根茎基础葡萄园。除了啤酒花特技类病毒 （HSVd） 感染外，这株藤蔓的40多种病毒因子检测结果都呈阴性，因此作为健康对照。所有葡萄藤均采用HTS和实施逆转录定量PCR（RT-qPCR）或如前所述的qPCR进行检测[26,27]。

    1. 菜豆黑龟豆（BTS）不同生育期PvEV-1和PvEV-2的相对浓度

在27℃、16/8光/暗条件下，6个BTS生物复制体在温室中生长。从第10天到第40天，每隔5天，每株采集2片叶子，合并为一个样本。每个样品保存在80℃，直到共采集42个样品。使用 Homex 研磨机在 10 mL 裂解缓冲液（4 M 异硫氰酸胍；0.2 M 乙酸钠，pH 5.0；2 mM EDTA；2.5%（w/v）PVP-40）中匀浆每个样品的1 g叶组织（ Bioreba，Reinach，瑞士），然后使用 MagMax 植物 RNA 分离试剂盒（ThermoFisher Scientific，Sunnyvale，CA，USA）进行 TNA 提取，不包括 DNase 处理。使用 Qubit（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）对 TNA 进行量化。根据制造商的协议，使用TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix试剂盒 （ThermoFisher） 每间隔五天通过RT-qPCR测量的PvEV的相对浓度。PvEV引物和探针来自Kesanakurti等人的研究[28]。热循环仪条件为50℃下5 min，94℃下20 s，94℃下3 s，60℃下30 s，循环40次。

    1. TNA和dsRNA提取

在5月下旬和10月（春季和秋季）分别采集了19株葡萄的叶柄和休眠藤条。处理叶柄或藤屑（665 mg/样品），加入35 mg BTS叶片组织，然后如上文所述提取TNA（表2）。BTS掺入量是根据5%或10%的BTS叶片与葡萄组织的比较（w/w）确定的（数据未显示）。TNA的质量和数量由Qubit和生物分析仪（Agilent）进行评估。根据Kesanakurti 等人[28]的方案，分别在3 g叶柄组织或2 g藤屑中加入150和100 mg BTS叶片组织，并提取dsRNA（表2），不包括DNase和RNase处理。

表1. 从Davis病毒收集中心和FPS基金会葡萄园收集的精选葡萄中检测到病毒或类病毒

AGVd：澳大利亚葡萄类病毒；ArMV：阿拉伯花叶病毒；GAMaV：葡萄小行星花叶相关病毒；GBV-1：葡萄藤badnavirus-1；GEV-1：葡萄藤enamovirus-1；GRLDaV：葡萄杆炎叶片变色相关病毒；GFkV：葡萄斑点病毒；GFLV：葡萄扇叶病毒；GKSV：葡萄克孜尔萨巴客病毒；GLRaV-1：葡萄卷叶相关病毒1、GLRaV2、GLRaV3、GLRaV4和GLRaV7；GVA：葡萄病毒A、GVB、GVD、GVE、GVF、GVL；GPoV-1：葡萄杆状病毒-1；GRBV：葡萄红斑病病毒；GRGV：葡萄红斑病毒；GRSPaV：葡萄藤茎点蚀相关病毒；GRVFV：葡萄球菌脉羽病毒；GYSVd-1：葡萄黄斑类病毒-1和GYSVd-2；HSVd：跳特技类病毒；satGVV：葡萄卫星病毒；HC：健康对照。

表2. 描述了在春藤和秋叶柄上广泛评价TNA和dsRNA提取方法的HTS运行。如有需要，加入BTS作为阳性对照

HTS Run

Tissue

No. VP a

No. VN b

Template

Spike-In

1

Cane

18

1

TNA

-

2

Petiole

18

1

TNA

BTS

3

Cane/Petiole

9/9

0/1

dsRNA

BTS

4

Cane/Petiole

9/9

1/0

dsRNA

BTS

a：病毒阳性样本；b：病毒阴性样本。

表3. 稀释系列HTS运行说明。三个样本集被分成四组。每个样品组包括未稀释的受病毒感染的春叶柄和秋藤的提取物，以及相应的20%、10%、5%、2%和1%的稀释度组成。所有提取液均重复制备，每个样品组共24个样品。样本集 1 = 藤 7； 样本集 2 = 藤 9； 样本集 3 = 藤 15。

HTS Run #

Tissuelt;

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