微生物毒素解毒及几种内生菌菌株对草莓炭疽病因药的抗真菌活性外文翻译资料

 2023-03-28 17:01:08

微生物毒素解毒及几种内生菌菌株对草莓炭疽病因药的抗真菌活性

原文作者 Zahra Alijani, Jahanshir Amini , Morahem Ashengroph , Bahman Bahramnejad

单位 Department of Plant Protection, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Department of Biological Science, Faculty of Science, University of Kurdistan,Department of Agronomy and Plant Breeding, Faculty of Agriculture, University of Kurdistan, Sanandaj, Iran

摘要：本研究从健康的草莓植株中分离出4种内生菌菌株，基于表型、生化特征和分子系统发育分析，分别为芽孢杆菌属菌株YN8、芽孢杆菌属菌株LN57、芽孢杆菌属菌株MN17和铜绿假单胞菌菌株EN18。在体外、体内和温室条件下研究它们作为生物防治剂对草莓炭疽病毒的影响。体外实验中，所有菌株均抑制了仙人掌科植物的生长。接种草莓果实和幼苗的疾病严重程度比对照显著降低，这可能是由于酶和抗真菌代谢产物的分泌。此外，通过薄层色谱法（TLC）提取和纯化病原菌产生的毒素，并通过傅里叶变换红外（FT-IR），H和C核磁共振（NMR）光谱（400和100 MHz）表征其化学结构。通过生物测定和光谱分析，研究了内生细菌菌株对提取毒素的解毒能力。用菌株MN17和EN18处理的真菌毒素的生物测定试验在草莓叶片上没有显示任何症状。此外，光谱分析表明，每个菌株的不同吸收系数与生物测定试验一致。

关键词：抗真菌代谢物； 解毒； H和C核磁共振； 毒素提取

1. 引言

炭疽菌若虫科是引起伊朗草莓炭疽病的C.acutatum复合物种的成员之一。果实腐烂可能是一个严重的问题，影响产量和质量，并在田间和收获时造成经济损失。该病可以发生在植物的所有部位，但主要是成熟果实的疾病。真菌病原体感染绿色水果，但最常见于成熟水果（Karimi等人，2017a）。使用化学杀菌剂等常用方法进行疾病控制是无效的（Karimi等人，2017b）。因此，使用生物控制剂（BCA）是控制疾病的机制之一。细菌内生细胞可以通过竞争营养和空间，分泌抗菌化合物和通过激活细胞防御反应诱导植物抗性来改善宿主植物对植物病原体的生长（Chen等人，2014）。此外，毒素的解毒或灭活可降低植物病原体产生的代谢物的毒性。毒素是低分子量的次级代谢物，在真菌生长过程中由某些真菌合成和排泄，即使在非常低的浓度下也会影响疾病的发展或症状的出现（Orolaza等人，1995;Greeff-Laubscher等人，2019）。毒素的产生发生在植物定植期间或之后的特定环境条件下。鉴定植物病原菌产生的毒素是研究与疾病发展有关的生化和分子机制的一个有趣课题，有助于疾病的生物控制和诱导抗性。这种毒素由不同种类的真菌产生，其结构不同，描述了植物上疾病症状和生物学特性的主要变化（Saikia等人，004;Ismaiel和Papenbrock，2015）。从炭疽菌物种中提取和部分纯化有毒代谢物的研究相当多。炭疽菌属产生了几种有毒代谢物，它们的结构也有报告（Saikia等人，2004年）。Olufolaji（2000）从镰刀菌中提取并部分纯化了有毒代谢物。基于生物解毒方法的策略，将毒素改性为毒性较小的代谢物，通常对环境更具体、有效和安全（Zhu等人，2017年）。细菌、真菌、植物和动物已被用于生物解毒。它们可以将毒素代谢、解毒或钝化为稳定、毒性较小甚至无毒的产品（Li等人，2020年）。

在本研究中，我们分离了拮抗内生细菌菌株Bacillus spp.YN8（GenBank登录号MH161563）、Bacillus spp.LN57（GenBank登录号MH161580）、Bacillus spp.MN17（GenBank登录号MH161578），在体外、体内和温室条件下，研究了健康草莓开花期绿脓杆菌EN18（GenBank登录号MH142640）及其抗若虫活性。然后，我们从仙人掌科植物中提取并鉴定了毒素，并研究了分离的内生细菌对产生的毒素的解毒或失活的生物学效应。

  1. 材料和方法

2.1病原体分离

Colletotrichum nymphaeae（GenBank登录号MK32221；菌株ID；伊朗324C）是从伊朗库尔德斯坦大学的采集培养物中获得的（Alijani等人，2019）

2.2. 草莓植物细菌菌株的分离和鉴定

从库尔德斯坦省卡米亚兰的健康草莓中分离到内生细菌菌株。小片样品（3–5mm）在70%乙醇（v/v）中表面灭菌1分钟，然后在2.5%次氯酸钠（v/v）中灭菌3分钟，再次在70%乙醇中灭菌30秒，然后用无菌蒸馏水清洗三次，并在无菌滤纸上风干。然后将不同部分（根、冠和叶）浸泡在10毫升无菌蒸馏水中，并静置30分钟。将50微升最终悬浮液接种在营养琼脂（NA）上（蛋白胨5克，牛肉提取物1克，酵母提取物2克，氯化钠5克，琼脂15克，pH值为7.0的1升dH2O）。最后一次冲洗样品时，将50mu;L的水培养在NA培养基上，以评估灭菌效率。在27plusmn;2℃的NA培养基上培养单个菌落获得纯化后的菌落。将分离物保存在添加20%（v/v）甘油的营养肉汤（NB）培养基中，-20℃保存。形态学、生理学和生物化学特征通过上述方法完成（Bergey和Holt，1994；Grimont和Grimont，2006）。通过16S rRNA基因测序的方法鉴定所选菌株。提取基因组DNA，并用通用引物形成16S rRNA基因片段的PCR反应（Alijani等人，2019年）。纯化的PCR产物通过Macrogen公司（韩国首尔）的ABI3730xl DNA测序仪进行双向测序。然后使用软件BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.5.3（Hall，1999）编辑序列。BLASTN算法用于检查结果序列。最后，基于邻居连接法和1000次的bootstrap测试，使用从NCBI MEGA version 7中提取的类似序列构建系统发育树，以确认系统发育树的可靠性（Kumar等人，2016）。还分析了芽孢杆菌菌株的生物合成脂肽基因，包括srfAA、FenD和ItuD。对FenD和ItuD基因进行PCR扩增，并在95℃下进行5分钟的初始变性，然后进行30次变性（94℃时1分钟） ，退火（55℃下1分钟，延长（72℃时1分钟）最后一次72℃下10分钟。用于脂肽基因的引物分别为FenD1f（5′-TTTGGCAGAGAGTTT-3′）、FenD1r（5′-GCTGTCTCTGTTTTC-3′）和ItuD1f（5′-GATGGCTCTCTCTCTTGGATGT-3′）和ItuD1r（5′-ATCGTCATGTGCTTGAG-3′），产物大小分别为964和647 bp（Gond等人，2015）。扩增srfAA基因的PCR条件为95℃初始变性4分钟，然后进行40次变性（94℃时1分钟），退火（55℃下1分钟），延长（70℃时1分钟）最后一次延长到70℃时5分钟。该基因的引物序列为SRFAF（5′-TCGGGAGACATCAT-3′）和SRFAR（5′-CCACCAACGGA TAATCCTGA-3′），产物大小为201 bp（Mora等人，2011）。

2.3植物生长促进特性

对每个菌株进行了各种抗真菌和促进植物生长的特性研究。根据Alijani等人（2019年）描述的方法测定铁载体和HCN生产的能力。将分离出的细菌分别接种到灭菌脱脂乳琼脂、几丁质琼脂（0.5%w/v）和文森特琼脂培养基上，并在28plusmn;2℃下培养，评估蛋白酶、几丁质酶和果胶酶的分泌能力（Shanmugaiah等人，2008年；Tiru等人，2013年；Aaisha和Barate，2016年）。将菌株接种在补充了0.2%（v/v）L-色氨酸的LB肉汤（LBB）培养基中，并通过与标准曲线进行比较来评估产生的IAA含量（Ben Abdallah等人，2016）。菌株产生赤霉素（GA），并使用标准曲线测量产生的GA浓度（Holbrook等人，1961年）。制备了Pikovskaya的琼脂培养基，并用于磷酸盐溶解（Dias等人，2009年）。为了评估内生细菌菌株的致病性，以烟草（Nicotiana taba cum L.）为指标进行了y 持续敏感反应试验（Ben Abdallah et al.，2016）。每个实验重复三次。

2.4体外分析

在双重培养法中，将每株细菌新鲜培养物作为一条线接种在含有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的平板的一侧，并在平板的另一侧放置一个直径为5 mm的7天龄病原体培养物圆盘（Moreira et al.，2014）。为了评估挥发性代谢物的效果，一个NA培养基平板上接种了每个细菌分离物的新鲜培养物，另一个PDA培养基平板上接种了7天龄真菌病原体培养物的5 mm圆盘。然后，将病原体平板反向放置在含有细菌培养物的底皿上，并覆盖副膜。在真菌病原体菌丝体生长的非挥发性代谢产物评估中，将菌株培养到100 mL锥形烧瓶中的PDB培养基（45 mL）中，并在转速为150 rpm、温度为27plusmn;2℃的摇床上保持培养48小时。然后，以5000 rpm的转速离心15分钟，并用0.22micro;m微孔过滤器过滤上清液。之后，在每个平板的PDA培养基上制备两个孔（直径5 mm），并将150micro;L菌株的培养滤液添加到平板中的每个孔中。在每个平板的中心接种一个直径为5mm的真菌病原体盘（Jangir等人，2018）。仅接种真菌病原体的PDA培养基作为对照。在三种方法中，培养皿的温度为25plusmn;2℃，持续培养7天。记录真菌菌落的直径，并使用以下公式计算每个菌株的抑制率：

I （%） = [（dc - dt）/dc] times; 100，其中dc是对照组病原体的径向生长，dt是治疗组病原体的径向生长（Islam et al.，2016）。

为了评估非挥发性代谢物对真菌病原体分生孢子萌发的影响，将200micro;L分生孢子悬浮液（1times;106 CFU/mL）、1 mL细菌培养滤液和5 mL PDB 培养基混合到试管中。仅含有真菌病原体孢子悬浮液的培养基用作对照（Alijani等人，2019年）。24小时后用光学显微镜检查分生孢子萌发，每次复制50个分生孢子。随后测试分生孢子萌发的抑制率（Alijani等人，2019年）。所有处理均由三个板组成。

2.5体内实验

利用成熟健康的草莓（Fragariatimes;ananassa Duch.）在体内研究了这些菌株对果实腐烂发育的抑制作用，所选果实大小和颜色相似，无疾病症状。水果用70%乙醇消毒30s，在无菌水中清洗三次。将草莓果实浸泡在每个菌株的细菌悬浮液（1times;108 CFU/mL）中5分钟。24小时后，将20micro;L病原体分生孢子悬浮液（1times;106孢子/mL）喷洒在接种的果实表面。用无菌蒸馏水和病原菌分生孢子悬浮液接种的果实分别作为阴性对照和阳性对照。每次治疗使用12次重复。将水果放入有盖的塑料盒中，并在25plusmn;2℃下储存、 75–80%相对湿度（RH）（Essghaier等人，2009年）。5天后，每个果实被视为一个圆锥形，记录高度和基部半径。然后，通过AutoCAD软件（2012版）使用以下公式测量疾病严重程度（DS）：

DS = A/（H times; 2pi;r）

其中，（A）为感染区面积，（H）和（r）分别为果实高度和果实基部半径（Alijani等人，2019年）。

2.6温室实验

使用两种方法在温室条件下对草莓植物c.v Paros（4周龄）评估细菌分离物对草莓炭疽病的生物防治功效。在土壤淋洗方法中，将4周龄幼苗的根部接种25 mL，每种细菌悬浮液1times;108 CFU / mL。第二种方法中，将5mL每种细菌分离悬浮液（1times;108 CFU / mL）喷洒在4周龄幼苗的地上部分。在这两种方法中，24小时后，向每株植物喷洒5毫升病原体接种物（1times;106孢子/mL）。植物分别接种无菌蒸馏水和真菌病原体分生孢子，作为阴性对照和阳性对照（Rakotoniriana等人，2013）。然后，所有的植物都被置于24到27℃、 相对湿度60-70%的温室条件下，光照16小时，黑暗8小时。接种两个月后使用以下量表调查疾病严重程度和生物防治功效：0 =健康叶柄无病变；1 =叶柄病变长度lt;3毫米长；2 =叶柄病变长度3-10毫米；3=叶柄病变长度10.1-20毫米；4=叶柄病变长度gt;20毫米；5=叶柄完全坏死，植物死亡（Delp和Milholland，1980）。通过[（对照疾病指数）-（治疗缓解指数）]/对照疾病指数times;100公式评估生防效果百分比。每个实验重复四次。在实验结束时，从接种的植物中重新分离病原体。

2.7. 从真菌病原体中提取毒素

在含有25毫升Czapec Dox液体培养基（蔗糖30克、NaNO3 3克、K2HPO4 1克、MgSO4·7H2

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