六堡茶发酵前后多糖的纯化、鉴定及生物活性研究外文翻译资料

六堡茶发酵前后多糖的纯化、鉴定及生物活性研究

原文作者：Hanao Qin, Li Huang, Jianwen Teng, Baoyao Wei, Ning Xia, Ying Ye

单位：College of Light Industry and Food Engineering, Guangxi University, Nanning 530004, China

摘要：从六堡茶的原茶和陈茶中分别提取原茶多糖(RLTPS)和陈茶多糖(ALTPS)，纯化得到5个精制组分。成分分析表明，发酵后六堡茶粗多糖含量从1.83plusmn;0.09 g / 100 g增加到3.44plusmn;0.28 g / 100 g，分子量降低。结构分析表明，精制ALTPS中鼠李糖、半乳糖和半乳糖醛酸的摩尔比增加。所得多糖均为含吡喃糖环结构的糖蛋白复合物。精制ALTPS的热稳定性和不对称性强于精制RLTPS。在体外活性方面，ALTPS相较RLTPS具有更好的抗凝活性和胆汁酸结合能力。精制ALTPS组分的活性虽然较纯化前有所降低，但仍高于精制RLTPS。发酵是提高黑茶品质和生物活性的重要途径。

关键词：六堡茶；发酵；茶多糖；结构；抗凝剂；胆汁酸

引言

根据茶叶发酵程度，通常将茶叶分为五类:未发酵茶(绿茶)、轻度发酵茶(白茶和黄茶)、半发酵茶(乌龙茶)、发酵茶(红茶)、后发酵茶(黑茶)(Tanaka, 2012)。六堡茶属于黑茶。它因其产地广西苍武县六堡乡而得名。在清代，六堡茶已经是中国24种名茶之一，至今已有1000多年的历史(Wu, 2014)。黑茶的制作过程涉及到多种微生物的参与，发酵前后的微生物群落会发生变化(Li, 2018; Zhang,2013)。因此，黑茶的活性成分包括茶叶中天然存在的物质和发酵过程中微生物作用产生的一些活性成分(Lv, 2017)。发酵是产生黑茶独特品质的一个重要过程。原茶发酵后，茶叶中的儿茶素衍生物、酚酸及其衍生物、黄酮醇、黄酮类化合物、糖苷在微生物发酵作用下发生动态变化，从而形成独特的色泽特征和醇香口感，产生木香(Ma, 2017; Zhu,2020)。

高脂血症可引起血管壁许多功能和结构的改变，促进动脉粥样硬化的发生(Long, Gahan，amp; Joyce, 2017)。胆汁酸是由肝脏中的胆固醇合成并释放到肠道中，用于帮助消化饮食中的脂质的。胆汁酸对于维持胆固醇稳态和防止胆固醇和甘油三酯积累至关重要(Chiang, 2013)。六堡茶的乙醇提取物具有调节高脂血症和抗凝血的作用，这在我们之前的研究中得到了证实(Huang, 2013)。Mao等人发现六堡茶多糖(TPS)显著提高了由高脂饮食诱导患高脂血症大鼠体内血脂酶,胆固醇氧化酶和抗氧化酶的活性并呈剂量依赖关系,同时会导致胆汁酸浓度显著增加,显示出良好的胆固醇结合能力(Mao,2018)。TPS是黑茶的功能成分之一，是与非淀粉蛋白结合的酸性多糖(Chen, 2007)。TPS具有多种生物活性，如抗肥胖(Chen, 2018)、抗凝血(Mao, 2018)、抗氧化(Yang, 2017)和调节肠道微环境(Wang, 2019)。

尽管六堡茶具有多种生理活性(Ding, 2019; Teng, 2014; Wu, 2015; Ye, 2019)，六堡茶多糖在发酵前后的变化尚不清楚。因此，本研究旨在从原六堡茶和陈年六堡茶中提取多糖，并对其精制后的成分和结构进行比较。此外，利用体外模型评价其抗凝血和胆汁酸结合能力，以确定发酵对于黑茶品质的重要性。

材料与方法

2.1材料与试剂

六堡茶陈茶和六堡茶原茶(均为三级茶)，购自中国广西梧州茶厂。绿茶(三级茶)，购自中国南宁百货公司。

Sephadex G-100凝胶，系列标准单糖(葡萄糖(Glc)、葡萄糖醛酸(GlcA)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、半乳糖醛酸(GalA)、鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)、阿拉伯糖(Ara)、核糖(Rib)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(TFA)、牛血清白蛋白(BSA)、胰酶购自Aldrich公司(美国Sigma)。聚酰胺树脂购自Solarbio有限公司(中国北京)。不同分子量的葡聚糖标准品购自国家食品药品监督管理研究院(中国北京)。DEAE-52纤维素、消胆胺、肝胆酸、肝胆酸去氧胆酸、肝胆酸去氧胆酸、牛磺酸去氧胆酸、牛磺酸去氧胆酸、肝素购自中国上海源业生物科技有限公司。所使用的其他分析试剂均来自国药化学试剂有限公司(中国上海)。

2.2六堡茶原茶和陈茶中粗茶多糖的提取与纯化

茶多糖按照我们报道的方法制备，稍作修改(Mao, 2018)。5000 g茶叶样品用80%的乙醇预处理24 h，去除部分色素、多酚等小分子。过滤后，用15体积的去离子水在70℃下萃取2 h，重复3次。随后，用RE-3000A旋转蒸发器(YaRong，CN)在60℃、60rpm的条件下将混合提取液浓缩到原体积的十分之一。浓缩过滤后的提取液，在4℃条件下用体积为4倍的95%乙醇沉淀24 h，收集沉淀，依次用乙醇、丙酮、乙醚洗涤3次，去除多酚等小分子。将残留的有机试剂蒸发冻干后，收集六堡茶原茶粗茶多糖 (RLTPS)和六堡茶陈茶粗茶多糖 (ALTPS)。采用Sevag法去除样品中的蛋白质，并用聚酰胺树脂动态吸附脱色。

用DEAE-52纤维素(phi;2.6 * 50 cm)柱以及蒸馏水和不同浓度的NaCl溶液(0.1、0.2、0.5 M)，洗脱RLTPS和ALTPS (50 mg)，平均流速为1.0 ml/min。从RLTPS中得到2个多糖组分RLTPS0和RLTPS5，从ALTPS中得到3个多糖组分ALTPS0、ALTPS2和ALTPS5。进一步通过Sephadex G-100凝胶层析(phi;2.6 *50 cm)，以平均流速0.5 ml/min，用蒸馏水收集较浓缩的分子量馏分。最后，用Alpha 2-4 LD 真空冷冻干燥机(CHRIST, DE)对洗脱液进行冷冻干燥，得到RLTPS0、RLTPS5、ALTPS0、ALTPS2和ALTPS5。采用苯酚-硫酸法跟踪测定。

2.3茶提取物的制备

用蒸馏水(预热至70℃)按1:15 (w/v)的比例提取绿茶、六堡茶原茶、六堡茶陈茶3次，70℃水浴(每次2小时)，混合后冷冻干燥保存。收集绿茶水提物(GTWE)、六堡茶原茶提物(RTWE)和六堡茶陈茶提物(ATWE)。

2.4化学组分分析

以Glc为标准，采用改进的苯酚-硫酸法(Albalasmeh, Berhe,amp; Ghezzehei, 2013)，分析中性糖含量。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用Bradford法(Bradford, 1976)，分析蛋白含量。以GalA为标准，用硫酸-咔唑法(Bitter amp; Muir, 1962)，分析糖醛酸含量。

2.5单糖组分

单糖的组成按照PMP柱前衍生化方法进行了分析，并稍加修改(Sun, 2009)。简单地说，每个样品(10 mg)用2 M TFA (2 ml)在密封管中水解6小时。完全水解后，将水解产物转移到25 ml比色管中，用3 mol/L NaOH溶液中和，用去离子水稀释至10 ml。将0.4 ml中和后的水解液与0.4 ml NaOH (0.3 M)、0.4 ml PMP (0.5 M)混合，置于70℃水浴中100 min，水浴后加入0.5 ml HCl (0.3 M)中和。用2.0 ml蒸馏水溶解混合物，加入10.0 ml三氯甲烷，充分混合，除去多余的PMP。最终溶液通过0.45 mu;m膜。多糖的单糖组成在Waters e2695 HPLC上进行(Waters，美国)。色谱柱为Waters Symmetry C18柱(100 Aring;， 5 mu;m, 4.6 mm * 150 mm)，流速为1.0 ml/min，温度为35℃，洗脱液为0.02 mol/L乙腈/磷酸钠溶液，进样量为20 mu;l。将每个标准单糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和核糖)的混合物置于相同条件下作为对照。测量数据用摩尔比表示。

2.6分子量分析

分子量分析是按照先前报道的方法进行的(Xu, 2014)。使用Waters e2695色谱仪(Waters, 美国)、超水凝胶线性柱(20 mu;l, 300 mm 7.8 mm, Waters, 美国)和微分折射率检测器，通过高效凝胶渗透色谱(HPGPC)测定每个细化样品的分子量。在40℃、流速0.8 ml/min的缓冲液(0.1 M NaNO3溶液)中注入样品和洗脱液20 mu;l。用不同分子量(1180、2700、9700、36800、133800 Da)的标准右旋糖酐对HPGPC体系进行了预标定。

2.7傅里叶转换红外光谱

将5个精制样品与干燥的溴化钾按1:100的比例混合，碾压。使用Frontier FT-IR探测器(PE，美国)在400-4000 cm ^-1范围内扫描观察峰谱。

2.8紫外光谱

将5种精制多糖样品配制成相同浓度(2 mg/ml)的溶液。以超纯水为空白溶液，用UV-1601 PC分光光度计(Shimadzu, 日本)在200-400 nm的波长范围内分析紫外光谱。

2.9扫描电镜(Sem)分析

取适量冻干TPS样品放置于样品台。抽真空后，样品被涂上一层导电膜。采用F16502 SEM (PHENOM, 荷兰)对样品进行观察，并在5000times;放大倍数下拍照。

2.10热重分析（Tga）

RLTPS0、RLTPS5、ALTPS0、ALTPS2和ALTPS5用DSC2-IK30R-F热重分析仪(METTLER TOLEDO, CHE)进行分析。升温速率为20℃/min，温度范围为30℃- 800℃，保护气(20 ml/min)和反应气(50 ml/min)选用高纯氩气(99.9999%)。

2.11圆二色性(Cd)光谱

将5种精制多糖样品配成1.0 mg/ ml溶液，作为空白对照。使用MOS-450CD谱仪(CBIO-LOGIC, FRA)在室温下分析CD光谱。波长范围为190 ~ 260 nm。

2.12体外抗凝血活性

贝克曼ACL7000凝血仪(BECKMANCOULTER，美国)用于前面所述的抗凝试验(Albuquerque等人, 2004)。凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶时间(TT)检测试剂盒购自青岛合奥生物科技有限公司。人血浆取自健康志愿者血液，与0.109 M柠檬酸钠以9:1的比例混合，低温(3000 rpm, 15 min)离心收集上层血浆。将待测样品溶于不同浓度(4、7.5、15、30和60 mg/ml)的0.9% NaCl中，与枸橼酸人血浆(v/v = 1:4)混合。对于APTT，血浆/样品混合物(50 mu;l)和APTT试剂(50 mu;l)在37℃孵育3 min后，加入0.025 mol/L CaCl2溶液(50 mu;l)，测定凝血时间。对于PT，血浆/样品混合物(50 mu;l)在37℃孵育3 min，然后加入在37℃预热的PT试剂(100 mu;l)，测定凝血时间。TT时，血浆/样品混合物(100 mu;l)在37℃孵育3 min，然后加入在37℃预热的TT试剂(50 mu;l)，测定凝血时间。肝素(1 mu;g/ml)和正常盐水分别作为凝血阳性对照和阴性对照。

2.13体外胆汁酸结合

胆汁酸结合分析按照Kahlon和Smith的方法进行，稍作修改(Kahlon amp; Smith, 2007)。胆汁酸检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。用磷酸盐缓冲液(pH = 6.8)配制混合胆汁酸原液(36 mmol/L)，其中含有9 mmol/L的肝胆酸、9 mmol/L的肝胆酸、9 mmol/L的肝胆酸、4.5 mmol/L的牛磺酚酸和4.5 mmol/L的牛磺酚酸。备液20℃保存，每次检测前用工作液(0.72 mu;mol/ml)稀释。将5种精制多糖样品10 mg、GTWE 5 mg、ATWE 5 mg、RTWE 5 mg、ALCTPS 5 mg、RLCTPS 5 mg、消胆胺5 mg分别添加到不同的50 ml螺旋盖管中。样品用1 ml HCl (0.01 mol L/L)在37℃的振荡水浴中消化2小时。然后用NaOH (0.02 mol/L)调节样品的pH值至7-7.5。样品加入4 ml工作液和5 ml 10 mg/ml胰酶(以pH = 6.8的磷酸为缓冲液配制)，37℃消化2 h，然后用0.02 mol/L的NaOH调节pH至7-7.5。样本添加4ml的工作方案和5ml 10 mg/ml 胰液素(以pH = 6.8的磷酸为缓冲液配制)，37℃消化2 h .样品消化后，6000 rpm离心20 min，取上清检测。采用胆汁酸检测试剂盒测定上清液中胆汁酸含量。胆汁酸结合活性计算如下:

2.14统计分析

所有消化实验都重复3次，结果以平均标准偏差(SD)表示。多样本比较采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析。p lt; 0.05，差异显著，具有统计学意义。

结果与分析

3.1多糖特征

RLTPS和ALTPS的纯化

采用溶剂萃取法和乙醇沉淀法提取RLTPS和ALTPS。干基含量分别为1.83plusmn;0.09 g/100 g和3.44plusmn;0.28 g/100 g。Chen

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