南非药用植物对产毒真菌的抗真菌、抗氧化活性和细胞毒性外文翻译资料

 2023-03-28 17:01:25

南非药用植物对产毒真菌的抗真菌、抗氧化活性和细胞毒性

作 者： N. I. Mongalo a,lowast;, P. M. Dikhoba b, S. O. Soyingbe b, T. J. Makhafola b

单位:University of South Africa, College of Agriculture and Environmental Sciences Laboratories, Private Bag X06,Florida, 0610, South Africa

摘要：

已知属于镰刀菌属和曲霉属的真菌菌株会感染农作物，导致粮食安全受到威胁，农作物产量减少。当前工作的目的是研究选定的南非药用植物提取物的抗霉菌毒素活性、细胞毒性作用和抗氧化潜力。研究了来自选定药用植物的叶子的水性和有机提取物对各种已知会感染作物并产生霉菌毒素的真菌菌株的抗真菌活性。还评估了抗氧化活性、总酚和总黄酮含量。 Milletia grandis (E. Mey) Skeels 的有机提取物对赭色曲霉、禾谷镰刀菌和尖孢镰刀菌的最低最低抑菌浓度 (MIC) 值为 0.01 mg/mL。通常，与水提取物相比，有机提取物显示出显着的抗真菌活性。 Carpobrutus eludis L. 和 Warburgia salutaris (G. Bertol) Chiov。揭示了对牛真皮和 Vero 细胞分别产生 0.01 mg/mL 的 50% 致死浓度 (LC50) 值的强细胞毒性作用。 Ricinus Communis L. 的 50% 抑制浓度 (IC50) 值为945 mg/mL 对 2, 2 二苯基-苦基-肼基 (DPPH)。 一般来说，与酚类物质相比，植物种类的类黄酮含量较低。 所选植物提取物的生物活性可能归因于高酚含量。

关键词：植物生物学

1引言

腐生真菌在收获前和收获后通过食物腐败和随后的霉菌毒素污染对人类和动物健康构成重大威胁[1]。由于它们无处不在的性质，这些真菌菌株感染和污染了多种粮食作物并且难以控制。不良的收割方式、不当的干燥、处理、运输和储存材料会导致真菌生长并增加霉菌毒素产生的机会，这可能直接对受影响地区的经济产生负面影响 [2]。高温、水分含量、加工和大雨也可能有利于一些真菌的生长[3]。在发达国家，食品中的霉菌毒素水平使用各种最新的技术工具、不同的质量标准和建议的每日摄入量进行调节 [4]。然而，重要的是要注意，这些法规可能不适用于发达国家和欠发达国家的大多数以农业为生的农村社区。[5]

据估计，到 2050 年，全球粮食产量应增加 50%，以满足世界人口的需求[6]。由于人口可能在很大程度上取决于食品生产系统的条件，因此这可能无法实现，主要因为镰刀菌属、曲霉属和青霉属[7]。这个问题是几种破坏性感染和各种致命人类疾病的普遍且经常公认的原因之一。这些菌株所在的主要农产品（如玉米、稻米和小麦）是大多数非洲国家的主食。已知这些属组的产霉菌毒素真菌种类会产生多种霉菌毒素或次生代谢物，一种菌株可能同时产生一种以上的霉菌毒素 [8, 9, 10, 11]。这些物种产生的最常见的霉菌毒素包括伏马菌素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和单端孢菌素 [12]。人类接触霉菌毒素的主要途径可能是直接食用受霉菌毒素污染的作物和动物制品、吸入和通过皮肤直接接触[13]。化学杀虫剂仍然是防治害虫的主要手段。

自由基，如活性氧 (ROS)、活性氮 (RNS) 和活性氯 (RCS) 在体内由包括呼吸链在内的各种生化反应产生。 这些分子被引入从外部环境进入体内，例如紫外线 (UV) 光、辐射、吸烟、空气污染、不健康的食物、压力、某些药物等。 人体内自由基分子的积累可能导致细胞损伤，从而引起人和动物的各种疾病[14]。 本论文旨在研究选定的南非药用植物对呋喃菌和曲霉属重要的食品污染真菌菌株的抗霉菌毒素生成潜力。 此外，为了探索这种植物提取物对 2, 2-二苯基-苦基-肼基 (DPPH) 一种稳定的自由基的抗氧化特性。 具有良好抗真菌和抗氧化活性的植物提取物可以很好地防止食品因氧化而变质。 这些真菌菌株很可能通过产生各种毒素，从而加快食品氧化。

2.材料和方法

2.1 植物材料和研究区域

所选药用植物的新鲜健康叶子（表1）是从夸祖鲁-纳塔尔省北部Empangeni地区KwaDlangezwa周围村庄的野外随机选择和采集的。 村庄如Vulindlela、Iniwe、Esikhaleni、Mthunzini、Ongoye、Amanziamnyama 和 Indabayakhe 被选为目前的研究对象。尽管传统医学通常使用根和茎皮来治疗各种感染（表 1），但在当前的研究中选择叶子作为生物多样性保护措施，以防止野外重要植物种群的退化和灭绝。

叶子分别收集到牛皮纸袋中，在室温下在通风良好的实验室工作台上阴凉干燥，以确保有效干燥而没有微生物侵袭，然后使用锤磨机（IKA Scientific，MF 10 B 型，德国）研磨成粉末（2 mm 目） ）。然后将粉末储存在密闭的塑料瓶中，直到需要为止。凭证标本由佛罗里达州尤尼萨大学生命与消费者科学系的植物学家 (Monde Nyila 博士) 收集、压制和鉴定。该样本在比勒陀利亚大学铒铒馆根据可用凭证进行了验证，代码为 PRU。另一个样本以代码 UNI 存放在 UNISA。将叶子收集到小袋中并在 15 ℃时干燥。

2.2 植物材料的提取

干燥的植物材料分别用热水和 1:1 甲醇:二氯甲烷（AR 级）萃取。 将水提取物按 1:5 w/v 煮沸，在实验室工作台上冷却，通过 Whatman 的 1 号纸过滤并冷冻干燥（Labconco Corporation，堪萨斯城，穆苏里，美国）。 有机提取物以 1:10 w/v 提取，在台式振动培养箱（Scientific，USA）上以 100 rpm 的速度保持过夜，然后通过 Whatman 的 no1 纸过滤，然后使用 Buchi 旋转蒸发仪（Bibby Scientific Limited，Stone Staffordshire ,英国）。 将所得的水性和有机来源的植物提取物称重，然后保存在 4°C 的冰箱中。

2.3 选定的真菌菌株

选定的真菌菌株

选择了镰刀菌、曲霉等6株植物病原真菌进行抗真菌活性试验。选定的物种是轮枝镰孢 (PPRI 10148)、尖孢镰刀菌 (PPRI 10185) 和禾谷镰刀菌 (PPRI 10340)、寄生曲霉 (PPRI 9153)、黄曲霉 (PPRI 14636) 和赭色曲霉 (PPRI 6816)。 真菌菌株于 2015 年从农业研究委员会-植物保护研究所 (ARC-PPRI) 购买（南非比勒陀利亚）。

2.4 抗真菌活性

所选药用植物提取物的抗真菌活性采用 Eloff [27] 采用的方法进行了轻微修改。所有的微生物都保存在新鲜制备的 Sabourand Dextrose Agar 上。用新鲜的 Sabourand Dextrose 肉汤 (Biolab, Merck, South Africa) 将每个菌株的过夜培养物稀释至约 1.1 107 cfu/mL 的浓度。简而言之，所选药用植物提取物的最低抑菌浓度 (MIC) 值是从 10 mg/ml 的储备溶液中确定的，该储备溶液在无菌蒸馏水中连续稀释两倍。然后将大约 100 mL 的标准化真菌培养物添加到所有孔中，产生 0.25 mg/mL 的最高浓度植物提取物。将大约 40 ml 的 0.2 mg/mL 新鲜制备的氯化碘硝基四唑 (INT) 添加到稀释的植物提取物中。显示紫色的孔表明真菌正在生长，而无色或绿色表明提取物抑制真菌的生长并报告为最小抑制浓度 (MIC)。在 24 和 48 小时的潜伏期后读取结果。

2.5 细胞毒性研究

使用 Mosman [28] 描述的基于四唑的比色法 (MTT) 测定从 Sigma Aldrich（德国）获得的牛真皮和 Vero 细胞对所选药用植物的 1:1 甲醇：二氯甲烷提取物的细胞毒性进行了测定。提取物以 100 mg/ml 溶解在 DMSO 中制备，并溶解在 DMEM 中以产生 1 mg/ml 的最终最高浓度。收获亚汇合培养的细胞并以 100 x g 离心 5 分钟，然后重新悬浮在生长培养基中至浓度为 5 104 个细胞/ml。使用的生长培养基是补充有 0.1% 庆大霉素 (Virbac) 和 5% 胎牛血清 (Highveld Biological) 的基本必需培养基 (MEM, Whitehead Scientific)。将约 200 ml 的细胞悬液移液到无菌 96 孔微量滴定板的第 2 至 11 列的每个孔中。将 MEM (200 ml) 添加到第 1 列和第 12 列的孔中以最小化“边缘效应”并保持湿度。将板在 5% CO2 培养箱中于 37°C 下培养 24 小时，直到细胞处于指数生长期。从细胞中吸出 MEM，然后用 150 ml 磷酸盐缓冲盐水（PBS，Whitehead Scientific）洗涤，并用 200 ml 不同浓度的选定测试丙酮提取物替换，一式四份。测试提取物的系列稀释液在 MEM 中制备。在吸取培养基和添加测试物质的过程中尽可能少地干扰细胞。将微量滴定板与测试化合物或药用植物提取物在 5% CO2 培养箱中在 37°C 下培养 48 小时。包括未处理的细胞和阳性对照多柔比星（辉瑞实验室）。

孵育后，将 30 ml MTT（Sigma，PBS 中 5 mg/ml 的储备溶液）添加到每个孔中，并将板在 37°C 下再孵育 4 小时。与 MTT 一起孵育后，小心去除每个孔中的培养基，不要干扰 MTT孔中的晶体。 通过向每个孔中加入 50 ml DMSO 来溶解 MTT 甲臜晶体。 轻轻摇动板直到 MTT 溶液溶解。 通过在微量酶标仪（Varioskan Flash，AEC Amsterdam Pty Ltd）中在 590 nm 波长处检测吸光度，立即测量 MTT 减少的量。 第 1 列中的孔，包含培养基和 MTT，但没有使用细胞来空白读板器。 LC50 值计算为与未处理细胞相比导致吸光度降低 50% 的测试植物部分或分离化合物的浓度。 提取物的选择性指数计算如下： 选择性指数 (SI) frac14; LC50 (mg/mL)/MIC (mg/mL) 在 48 小时孵育时间[29]。

2.6 DPPH测定

有机提取物的 DPPH 自由基清除活性采用 Brand-Williams 等人[30]采用的方法进行了轻微修改。在目前的研究中，仅使用 DPPH 测定，因为自由基比其他方法更稳定，因此用作抗氧化测定的代表性模型。很快，将 3.75 mg DPPH 溶解在 100 mL 甲醇中。将植物提取物制成 5 mg/ml 的溶液，溶于 DMSO。将约 150 mL DMSO 添加到 96 孔板中，并在第一孔中添加等量的植物提取物，然后连续稀释两倍。然后将约 150 mL 的 DPPH 溶液添加到所有孔中。将板在黑暗中孵育 1 小时，然后使用酶标仪（Varioskan Flash，AEC Amsterdam Pty Ltd）在 517 nm 处读取。抗坏血酸用作阳性对照，而甲醇和DMSO用作阴性对照。使用以下公式计算抑制百分比。清除能力 frac14; OD 样品 OD 样品空白/OD 对照 OD 对照空白 100。然后从使用构建的线性图中确定导致 DPPH (IC50) 减少 50% 的植物提取物浓度对植物提取物浓度的抑制百分比。

2.7 总酚含量的测定

使用 Makkar [31] 描述的 Folin-Ciocalteu 方法测定所选药用植物的有机提取物的总酚含量，稍作修改。简而言之，将 25 mL 粗植物提取物 (0.5 mg/ml) 用 250 mL Folin-Ciocalteau 试剂处理 5 分钟。通过添加约 750 mL 20% 无水碳酸钠终止反应。用蒸馏水定容至 5 mL，室温避光孵育 2 小时。孵育后，用分光光度计（Varioskan Flash，AEC Amsterdam Pty Ltd）在 760 nm 处读取吸光度。酚含量由不同浓度没食子酸 DMSO 的标准曲线确定。结果表示为 mg/g 没食子酸当量 (GAE)。

2.8 总黄酮含量的测定

使用从 Yadav 和 Agarwal [32] 采用的方法测定有机提取物的总黄酮含量，稍作修改。将 0.5 mg/ml (100 mL) 粗提物溶解在 300 mL 甲醇中，向其中加入 20 mL 10% 氯化铝。再加入 20 mL 1 M 乙酸钠到解决方案。所得溶液用蒸馏水定容至 1 mL。将其在室温下孵育 30 分钟。孵育后，在酶标仪（Varioskan Flash，AEC Amsterdam Pty Ltd）中在 450 nm 处读取吸光度。槲皮素 (10 mM) 用作标准品。每种提取物的黄酮含量表示为 mg/g 槲皮素当量 (QE)。

2.9统计分析

使用 ANOVA 分析当前研究中的结果。在抗真菌研究中，结果被记录为三个独立实验的平均值，而细胞毒性、抗氧化活性

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