双酚A暴露诱导非洲爪蟾细胞凋亡，损害早期胚胎发育外文翻译资料

 2023-03-28 17:05:08

双酚A暴露诱导非洲爪蟾细胞凋亡，损害早期胚胎发育

作者：Yaming Ge a, 1, Fei Ren a, b, 1, Lingli Chen a, Dongfang Hu a, Xinrui Wang a, Yunli Cui a,Yu Suo a, Hongli Zhang a, Junping He b, Zhihong Yin a, Hongmei Ning a, *

单位 a河南省科学技术学院动物科学与兽医学院，河南省新乡，453003

b山西农业大学动物科学与兽医学院，山西太谷，中国，030801

摘要：双酚A(BPA)是一种内分泌干扰化学物质，主要生产和用于塑料工业，它会造成环境污染，并通过食用聚碳酸酯容器中的食品和液体而被人类吸收。双酚a对胚胎和后代具有发育和遗传毒性，但这种化学物质的胚胎毒性机制尚不清楚。本研究旨在探讨双酚a对胚胎发育的毒性作用，并阐明其毒性机制。以不同浓度(0.1、1、10和20mu;M)处理非洲爪蟾胚胎为模型，研究BPA的发育毒性。双酚a暴露24h-96h监测胚胎发育和行为。BPA浓度大于1mu;M对爪蟾胚胎具有显著的致畸作用，主要畸形为尾轴短、内脏曲和脊索弯曲。经20mu;M BPA处理的胚胎在各方面均有严重损伤，并表现出畸形、行为能力受损和组织损伤。同时，我们还研究了非洲爪蟾胚胎的DNA完整性和细胞凋亡情况。暴露于高于0.1mu;M的BPA浓度可显著诱导DNA损伤(plt;0.05)。与对照组相比，10mu;M和20mu;MBPA处理的胚胎显示出更高水平的裂解caspase-3蛋白。在10mu;M和20mu;M处理的胚胎中，bax/bcl-2mRNA的比值显著高于对照组。综上所述，BPA可延缓非洲爪蟾胚胎的早期发育，诱导DNA损伤和细胞凋亡，并最终导致非洲爪蟾胚胎的多种畸形。

关键词：双酚A；非洲爪蟾胚胎； 发育毒性； DNA损伤; 细胞凋亡

  1. 引言

双酚A(BPA)，又称4,4，-异丙基亚氧二苯二酚，2,2，-bis（4-羟基苯基）丙烷，是一种具有两个酚基的有机化合物(Huangetal.，2012)。20世纪50年代引入塑料工业，估计全球每年产量超过380万吨(MacKay and Abizaid，2018)，并每年稳步增长。双酚a被用于生产聚碳酸酯刚性塑料、环氧树脂、铝或钢饮料和食品的树脂衬里罐。双酚a广泛存在于水、空气、灰尘和食品中，由于环境和生态危害以及对公众健康的潜在风险，引起了人们的广泛关注。人类可通过食用聚碳酸酯容器中的食物或饮料摄入双酚a(Almeida et al., 2018; Cao et al., 2011;Maragou et al., 2020; Preethi et al., 2014)。

在95%以上的普通人群中，BPA可以在血清、尿液、唾液、甚至牛奶和脂肪组织中检测到(Sakhietal.，2014)。BPA是一种雌激素内分泌干扰化学物质，可影响发育性（Ferris et al., 2016; Li and Zhao, 2019）和遗传对胚胎和后代的毒性（(McCue and DeNicola, 2019; Souder and Gorelick, 2018;Wolstenholme et al., 2019）。BPA可通过胎盘屏障(Nesanetal.，2018)，并对胚胎发育产生不利影响。Ferris et al. (2016)发现BPA可以抑制减数分裂，降低卵母细胞质量，影响胚胎活力。BPA可以剂量依赖的方式降低牛体外成熟的卵母细胞和胚胎的质量，干扰发育基因的表达，降低胚胎发育速率，增加细胞凋亡率，干扰性别比例。Arancio et al. (2019) 对非洲爪蟾进行BPA、BPAF、DBP和17b-雌二醇急性暴露96h，结果显示BPA(1-50mu;M)破坏了胚胎分裂，减缓了胞质分裂，使胚胎细胞分离。Zhu et al. (2020) 发现BPA上调爪蟾肠道notch相关基因表达，受损细胞增殖和组织学变化。Huang et al. (2020) 发现，亲代斑马鱼暴露于1mmBPA诱导转录组变化，涉及后代的表观遗传调控、氧化应激、凋亡和DNA损伤。虽然BPA对胚胎的发育毒性已有报道，但其机制，特别是引起体轴弯曲的机制尚不十分清楚。

作为胚胎发育研究的模型，爪蟾胚胎被广泛用于胚胎毒性研究（FortandMathis，2018；Mouche et al.2017）。本研究通过测量非洲爪蟾胚胎发育过程中的发育指标，对畸形发育进行评分，并评估畸形的严重程度。此外，还探讨了该化学物质的致畸机理。畸形评分(SOM)和表型特征被认为是评估BPA对胚胎发育毒性的新端点。我们首先评估了BPA对非洲爪蟾胚胎基因组DNA的损伤，并采用不同的方法评估了胚胎凋亡情况。本研究可为探讨BPA毒性的靶器官及作用机制提供参考。

缩写：ae：腹部水肿；bn：脊索弯曲；bt：尾巴弯曲；cfd：颅面水肿；dcg：水泥腺移位；eh：心脏水肿；ep：直肠水肿；et：躯干增大；esc：眼大小变化；gmc：肠道扭曲；hop：色素减退；mcp：小头畸形；nf：窄鳍；sta：短鳍；ss：短尾轴；st：分支；sb：发育不良；nt：神经管；no：脊索；尾DNA%：彗星尾部中DNA的百分比；尾长：彗尾的长度，从头部区域的右边界到尾的末端（以像素为单位）；尾矩：尾巴DNA%times;尾巴长度([尾巴中DNA的百分比]times;[尾巴长度])；彗星试验：尾DNA%times;(TailDNA的百分比)times;[尾部DNA的重心与尾部的重心之间的距离头部DNA在x方向上的重力])。

2、材料和方法

2.1.非洲爪蟾的维持和胚胎的收集

这项研究是根据《涉及动物的生物医学研究的国际指导原则》(http://www.cioms.ch/frame 1985 texts of guidelines. Html)并经河南省新乡河南科学院动物护理与使用机构委员会批准。将成年非洲爪蟾置于被维持在室温23plusmn;1℃，并进行昼夜循环（12小时光照：12小时黑暗）。的条件下培养，成体雌蛙在背侧淋巴囊内单次注射700IU人绒毛膜促性腺激素。16小时后，通过挤压下腹手工收获卵子，并排出到少量含有0.1times;Marc改良林格氏菌(MMR)的盘子中。一名成体雄蛙在麻醉后被解剖。一个睾丸被切碎，用0.1MMR悬浮，然后与排出的卵子混合。允许受精持续约30min，然后使用2%的l-半胱氨酸缓冲液(pH8.0)去除卵子周围的胶质层。20min后，倒出缓冲液，用0.1MMR轻轻洗去胚胎3次。根据纽沃科普发育阶段和费伯发育阶段，用塑料移液管选择健康受精卵，以进行以下方案(Nieuwkoop and Faber, 1994)。

2.2.介质和化学物质的暴露

双酚A储备溶液（纯度ge;99%，Cas:80-05-7，Sigma-Aldrich）在二甲基亚砜（DMSO）中制备（cas:67-68-5，Solarbio，China）。用0.1MMR稀释原液(所有工作溶液均含0.1%DMSO)制备BPA工作溶液。然后，以0.1MMR中的0.1%DMSO为阴性对照，以0.1MMR为空白对照。

将双细胞阶段的胚胎分装到F60mm玻璃培养皿中（每个培养皿20个胚胎），包含15mL的对照或处理溶液，然后在22plusmn;0.5℃下孵育。工作液每24小时更新一次，用塑料移液管排出死胚胎。

在24小时的暴露周期中，分析了BPA的稳定性。简而言之，使用超高效液相色谱(UHPLC)系统 (Agilent 1290 infinity II, Agilent technologies Inc., USA)和热科学透明金C18柱(3.0 mm times;100 mmtimes;1.9 mu;m, Thermofisher, USA)测定工作溶液中的BPA浓度。流动相由乙腈和0.1%乙酸（65：35、V/V）组成，流速为0.3mL/min。激发波长和发射波长分别为230nm和313nm。

2.3.LC50和TC50的测定

用浓度为1、5、10、13.3、16.6、20、23.3、26.6和30mu;M的BPA溶液处理胚胎，并以0.1MMR作为对照96h。每个处理重复进行3次，每个重复进行20个胚胎。通过计算缺乏心跳或触觉反应的胚胎数量来评估胚胎死亡率。畸形率是通过计算存活胚胎中的畸形数量来估计的。采用GraphPadPrism5.0(GraphPad Software, San Diego, CA)(抑制剂或s型剂量反应)计算96h中位致死浓度(96hLC50)和96h中位TC50)，采用非线性回归(抑制剂或s型剂量反应)。

2.4.LaevisX.生物测定

分别用BPA(0.1、1、10和20mu;M(96hLC50和96hLC50的1/200、1/20、1/2))、0.1%DMSO和0.1MMR处理胚胎。每个处理共4个重复，每个重复20个胚胎。使用40立体显微镜 (SZX7, Olympus,Japan)计算48、60和72小时的心率，测量每个重复中10个胚胎的心率。

在BPA暴露96h后，评估幼虫(NF第45期)的生长情况。幼虫用4%多聚甲醛(PFA)固定过夜，并在20个立体显微镜下 (SZX7, Olympus,Japan)成像。采用ImageView软件（中国苏州京通仪器有限公司）测量幼虫的全长、头长、眼距和眼直径（平均左眼直径和右眼直径）。

以SOM和表型谱作为新的终点，以评估BPA对胚胎的发育毒性。每个培养皿随机选取10只暴露于BPA96h的幼虫，作为重复。试验共4个重复（共40只）。根据畸形的严重程度对每种表型进行评分。根据Hu等人对表型进行分类和评分。(Hu et al., 2015)。计算17种表型的总分平均值，并记录为胚胎的SOM。

采用BPA暴露48、60、72h的触觉反应和96h的自主游泳反应进行行为分析。用塑料吸管触摸背部尾部和头部区域，检测触摸反应。每个处理对10个胚胎进行触觉反应试验，并在4个重复进行试验。每个培养皿中选取5只幼虫（每个处理组共20个胚胎）通过智能视频跟踪软件(智能3.0，Panlab，Span)进行自主检测，记录他们的游泳轨迹、距离和速度的游泳能力。

2.5.组织切片

将BPA作用96h的胚胎在4%PFA磷酸盐缓冲盐水(PBS)中固定12h，用乙醇和二甲苯脱水，石蜡包埋，然后切成8mm厚的切片。对腹部背腹轴脊索横切面进行常规苏木精伊红(HE)染色和免疫荧光染色。对脊索中部沿前后轴的纵断面进行末端二聚核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色和免疫荧光染色。

2.6.单细胞凝胶电泳

为了确定BPA处理后的胚胎细胞中是否发生了DNA损伤，按照Speit等人的描述，进行了碱性单细胞凝胶电泳(SCGE，也称为彗星实验)。(Speit and Rothfuss, 2012)，并做了一些修改。简而言之，暴露于BPA96h的胚胎用胰酶和II型胶原酶消化，用200过滤器筛选，然后用PBS稀释得到单细胞悬液。载玻片上覆盖了一层80mL的0.5%正常熔点琼脂糖(NMA，56℃)。将细胞(5mL，包含约1000个细胞)与75mL的0.5%低熔点琼脂糖(LMA，37℃)混合，然后作为第二层在载玻片上分层。然后，第三层覆盖85mL的0.5%LMA。覆盖每层覆盖物，当琼脂糖在4℃固化时被移除。将载玻片浸泡在冷裂解液(2.5M氯化钠，100mMNa2EDTA，10mMTris，1%肌糖苷酸钠，pH10,1%Triton-X-100,10%DMSO)中，在4℃下过夜，然后用PBS洗涤3次。载玻片在碱性溶液(1mMNa2EDTA，300mM氢氧化钠，pH13)中孵育30min，然后在25V和300mA下电泳20min。电泳后，用0.4MTrisHCL(pH7.5)中和15min，然后用30mu;mg/mL红色荧光核酸染料（solarbio, China）染色20min。

荧光图像是在荧光显微镜下拍摄的(Eclipse 50i, Nikon, Japan)，以400倍放大。每次处理随机选取100颗彗星进行分析如下。尾巴长度，彗尾DNA的百分比，彗尾（尾巴的百分比尾巴长度）和尾巴的DNA的重心和头部的重心在x方向)计算CASP1.2.3(彗星分析软件程序，CASPLab)(Konca et al., 2003)。

2.7.幼虫的细胞凋亡分析

2.7.1.吖啶橙(AO)染色

BPA96h的幼虫用PBS洗涤3次，然后用5mg/mLAO(Solarbio，China)室温黑暗处理20min。染色后的幼虫用PBS冲洗3次，用0.1%三卡因甲烷磺酸盐(MS-222，Sigma)麻醉5min，然后用荧光显微镜 (SZX16, Olympus, Japan)拍照，放大20倍。荧光强度由ImageJ软件(National Institutes of Health, NIH)进行定量，并用SPSS20(SPSS, Chicago, USA)进行分析。

2.7.2.TUNEL染色

根据制造商的说明，使用TUNEL染色试剂盒(Boster, Wuhan, China)进行TUNEL染色。简而言之，组织切片用新鲜制备的3%过氧化氢在室温下处理10min和0.5%蛋白酶K(cas：39450-01-6，China)，0.01M三缓冲盐水(T

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