解开斑马鱼侧线胆碱能传出突触的分子参与者外文翻译资料

 2023-03-28 17:05:23

解开斑马鱼侧线胆碱能传出突触的分子参与者

作者：Agustiacute;n E. Carpaneto Freixas,1 Marcelo J. Moglie,1 Tais Castagnola,Lucia Salatino, Sabina Domene,Irina Marcovich,1 Sofia Gallino,Carolina Wedemeyer,1 Juan D. Goutman, Paola V. Plazas,2p and Ana Beleacute;n Elgoyhen1p

单位：1基因和生物分子研究所，国家和生物研究研究所，阿根廷布宜诺斯艾利斯1428号，2阿根廷布宜诺斯艾利斯大学，阿根廷布宜诺斯艾利斯大学1121号，3“内分泌学研究中心”。塞萨尔·贝加达(CEDIE)，国家内分泌科，尼诺斯医院内分泌科，阿根廷布宜诺斯艾利斯1425号

摘要：侧线(LL)是一种让鱼类和两栖动物探测水流的感觉系统。传出神经元调节LL反应，帮助区分外部刺激和自我产生的刺激，保持对相关线索的敏感性。传出系统的一个组成部分是胆碱能，它的激活抑制传入活动。LL毛细胞(hc)与耳蜗的毛细胞在结构、功能和分子上都有相似之处，这使得它们成为研究人类听力和平衡障碍的流行模型。由于这些共性，可以提出在LL传出突触的受体是a9a10烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)。然而，ach介导的抑制在LL中的潜在分子的身份仍然未知。令人惊讶的是，通过对单细胞表达研究和原位杂交的分析，我们发现a9亚基(而不是a10)在斑马鱼的hcc中富集。此外，斑马鱼a9亚基的异源表达表明，同源性受体具有功能性，并表现出被a-bungarotoxin和士的宁阻断的AChgated currents。此外，在机械刺激的斑马鱼LL HC的体内Ca21成像显示，ACh引起Ca21信号的降低，无论HC极性如何。这种作用被a-bungarotoxin和apamin阻断，表明ach介导的作用与小电导ca21活化钾(ks)通道偶联。我们的结果表明，含有a9的(a9p) nAChR作用于斑马鱼LL传出突触。此外，a9p nachr的激活很可能导致SK通道作用的LL HC超极化。

关键词：钙成像;传出;侧线;烟碱受体;非洲爪蟾蜍卵母细胞;斑马鱼

1.显著性声明

鱼的侧线(LL)机械感觉系统在结构、功能和分子上与哺乳动物的耳蜗相似。因此，它已成为研究人类听力和平衡障碍的一个可行模型。然而，分子角色服务传出控制的LL毛细胞(HC)活动尚未确定。在这里，我们证明，不同于脊椎动物的听觉器官，一个仅由a9亚基组成的烟碱乙酰胆碱受体作用于LL传出突触。含有a9受体的激活导致llhc超极化，这是由于小电导ca21激活的钾离子通道打开所致。这些结果将进一步帮助解释从低级别hc作为耳蜗hc模型获得的数据。。

2.引言

对外界刺激的处理是所有生物体对环境线索作出适当反应所必需的。鱼类和两栖动物都有一个机械感觉系统，即侧线(LL)，它可以感知水动力信息，这对障碍和躲避捕食者、鱼群、捕获猎物和变异性等行为至关重要(Partridge and Pitcher, 1980;Bleckmann和Zelick, 2009;McHenry等人，2009年;Suli等人，2012年;Oteiza等人，2017)。LL由被称为神经胶质细胞的细胞簇组成，这些细胞由被非感觉细胞包围的机械敏感毛细胞组成(Metcalfe et al.， 1985)。LL型hc将感觉信息传递给投射到后脑的传入神经元(Metcalfe等人，1985;梅特卡夫,1989;廖,2010)。此外，它们受下行传出纤维支配，调节LL对外界刺激的反应(Metcalfe et al.， 1985;Bricaud等，2001)。鱼的解剖研究显示，后脑有两个胆碱能传出核，前脑有第三个多巴胺能核(Hashimoto et al.， 1970;罗伯茨和拉塞尔，1972年;佐托利和范霍恩，1983年;特里卡斯和海斯坦，1991年;Bricaud等，2001)。在运动过程中，LL传出的胆碱能调节有助于动物区分外部刺激和自我产生的刺激，保持对相关线索的敏感性(Lunsford et al.， 2019)。虽然已知D1b受体介导多巴胺能传出突触的神经传递(Toro et al.， 2015)，但胆碱能传出突触缺乏这一信息。在哺乳动物中，研究得最好的传出- hc突触，胆碱能内侧榄耳蜗(MOC)传出系统与hc进行直接突触接触。MOC活性的净效应是超极化hc (Guinan和Stankovic, 1996)，以激活a9a10烟碱乙酰胆碱受体(nachr)。对异体系统和发育中的耳蜗外植体hc的研究表明，a9a10受体具有独特的功能特性和高钙(Ca21)通透性(Elgoyhen et al.， 2001;Goacute;mez-Casati et al.， 2005;Ballestero等人，2011)。随后激活的小电导ca21激活的钾通道2 (SK2)驱动HC超极化(Dulon et al.， 1998)。虽然类似的分子可能表达在所有脊椎动物的传出突触，这一信息是缺乏的LL hc。然而，对于哺乳动物传出- hc突触中存在的受体的描述可能并不一定适用于其他物种，因为哺乳动物a9a10 nAChR已经被积极选择，使受体具有独特的功能特性(Franchini和Elgoyhen, 2006;Lipovsek等人，2012;Marcovich等人，2020年)。

LL型hc与耳蜗在结构、功能和分子上都有相似之处，这使得它们成为研究人类听力和平衡障碍的流行模型(Nicolson, 2005)。特别是，对LL和内耳的传出刺激(stim)会导致传入传播的抑制(Russell, 1971;罗伯茨和拉塞尔，1972年;弗洛克和拉塞尔，1976年;Lunsford等人，2019;Pichler和Lagnado, 2020)，因此表明类似的突触机制。这很可能是由胆碱能传出纤维引起的(Dawkins et al.， 2005;Zhang et al.， 2018)直接接触LL hc的基底(Dow et al.， 2018)，类似于MOC传出物的描述。此外，与耳蜗外型hc相似，LL型hc有一个与传出端相反的突触后池，这被认为参与Ca21的区隔化和/或Ca21诱导的Ca21释放机制(Lioudyno et al.， 2004;福克斯,2014;Moglie等人，2018年;Zachary等人，2018)。这些证据表明，在LL传出突触的nAChR可能是由a9和a10个nAChR亚基组成的。

为了验证这一假设，我们采取了多管齐下的方法，包括分析最近的单细胞表达研究、斑马鱼a9a10nachr亚基的克隆以及重组a9a10nachr受体的生物物理和药理特性。此外，我们对斑马鱼LL hc进行了体内Ca21成像，以表征天然nAChR的生理特征。我们提供了强有力的证据支持这一观点，即LL传出胆碱能突触的抑制特征很可能是由a9同分体受体服务的，以及随后ca21依赖的SK钾通道的激活。

3.材料与方法

斑马鱼毛细胞中富集基因表达的交叉研究评价。来自三个单细胞RNA测序的预处理数据集(RNAseq；埃里克森和尼科尔森，2015年;Matern等人，2018;郁郁葱葱al., 2019）和一个微阵列芯片（斯坦纳等人，2014)研究采用评估斑马鱼hc基因表达的方法表1).按通用名称和登录号进行基因搜索。对于所有的数据集，我们使用已发表的归一化和批校正的基因相对表达定量，并计算每个研究的hc和对照(Ctrl)细胞之间的差异作为Log2为了在不同的研究之间进行比较(表2).p根据错误发现率调整后的值或从每个单独的研究中获得的q值。从微阵列数据集中，我们使用了HCvsmCh1, GFP1地幔数据。在本研究的案例中Lush等。(2019)，我们使用了成熟的hc和其他神经肥大细胞(包括未成熟的hc)。

斑马鱼nAChR/cdna的克隆。使用TRIzol(ThermoFisher科学公司)从受精后7d(dpf)胚胎中分离出斑马鱼RNA。利用上标III第一链合成系统（赛默飞世尔科技公司）的聚合t引物对mRNA进行逆转录，获得全胚胎cDNA。基于以下序列报道的基因组参考联盟z11，特定引物设计放大全斑马鱼9(ENSDARG000000054680)和10(ENSDARG000000011113)nAChR亚基cDNA：9意义(59-ATGAAGAGCAGTAGCAAATAATAATAAC-39)；9反义(59-AATTGCAAGTTGTAAAC-39)；10意义(59-ATGATTTTATACTATATCC-39)；10反义(59TCAAATGGCTTTCCCCATTATAAG-39)。在两种情况下使用了35个循环，退火温度分别为45°C，9亚基为45°C和50°C。PCR产物使用TOPOTA克隆试剂盒（赛默飞世尔科学公司）将其亚克隆到pCR2.1-TOPOTA载体中，并进行测序，以验证正确扩增。

非洲爪蟾卵母细胞中重组受体的表达。将斑马鱼a9和a10cdna亚克隆到pSGEM载体中，这是一种适合于X的改良pGEM-he载体。laevis卵母细胞表达研究(Liman等人，1992).所有表达质粒均可随时索取。使用RiboMAX大规模RNA生产系统-T7(Promega)从与NheI线性化的质粒DNA模板中，在体外转录包膜crna。两者都是对X的维护。Laevis和V期和VI期卵母细胞的制备和cRNA注射已经在前面详细描述过(Katz等人，2000年).通常，卵母细胞注射50nl含有0.01-1.0ngcrna的无rnase水，并在18°C的Barth溶液中保持。采用1：2a9/a10摩尔比实现异聚受体的表达。

用GeneClamp500B电压和贴片钳放大器（分子器件）在双电极电压钳下注射cRNA后2-6d进行电生理记录。数据采集使用Digidata1200和pClamp7.0软件（分子设备），采集速度为10点/秒。电压和电流电极均填充3M氯化钾，电阻为；0.5-2M9V。数据使用来自pClamp7软件套件（分子设备）的Clamapfit进行分析。在电生理记录过程中，卵母细胞连续注入(10ml/min)(mM)：115氯化钠、2.5氯化钾、1.8CaCl2和10HEPES的缓冲液，pH为7.2，在弗雷克萨斯等药物的灌注溶液中应用。横向传出突触烟碱受体至卵母细胞室。持有潜力（Vhold)为70mV，除非另有说明。

为了尽量减少Ca2 通过nAChRs进入原生卵母细胞的Ca2 敏感氯化物电流(IClCa)的激活(迈尔迪帕克，1984年;博顿等人，1989年)，所有实验均在经透膜Ca2 预孵育的卵母细胞中进行Ca2 螯合剂bis(2aminophenoxy)ethane-N，N，N9，N9-tetra-acetic酸(BAPTA)-AM（100毫米）在电生理记录前放置3小时，除非另有说明。这种治疗方法以前已被证明可以有效地螯合细胞内的Ca2 离子，从而损害了一氯化碘的激活加拿大(格萨尼奇等人，1994年).通过测定对乙酰胆碱浓度增加的反应，得到了浓度-响应曲线。

评估Ca2 是nachr上向内电流的主要成分，我们利用了内源性的一氯化碘加拿大卵母细胞(米莱迪和帕克，1984年;博顿等人，1989年)作为Ca2 通过nAChRs输入。在BAPTA-AM中孵育3小时前后，在同一卵母细胞上的正常青蛙生理盐水中测量电流振幅。分别测定每个卵母细胞在BAPTA孵育后剩余的初始反应的百分比。然后测定每个受体的BAPTA后反应百分比的平均值和扫描电镜。

细胞外Ca2 通过测量对近EC响应的振幅，研究了通过nachr的离子电流50ACh的浓度(910mM；a9a10300mM)改变该阳离子的浓度从名义上的0-3mM维霍尔德的90mV (韦斯陶布等人，2002年)。在每个Ca2 处获得的振幅值，Ca2 浓度归一化到同一卵母细胞在1.8mM下获得的浓度。取不同卵母细胞的平均值，以6SEM表示。这些实验是在卵母细胞中进行的，其中注射了7.5ng的寡核苷酸(59-g的寡核苷酸)反义连接c38mRNA(阿雷拉诺等al., 1995;埃比哈拉，1996年)，以尽量减少卵母细胞通过半膜连接通道的非选择性内向电流的激活，以响应外部二价阳离子浓度的降低。

通过长时间(1min)激动剂应用来评估，浓度比EC高一个数量级50每个受体。测定每个卵母细胞反应峰值后20秒剩余电流的百分比。电流-电压(I-V)关系是通过从70mV的保持电位从120到150mV，在对ACh的平台响应(浓度低于EC的一个数量级50为每个受体)。在应用ACh前，通过对相同电压斜坡协议获得的I-V曲线进行数字减去来进行泄漏校正。

斑马鱼的畜牧业和路线。斑马鱼(Daniorerio)在E3胚胎培养基中以14：10h的光/暗循环生长(mM：130氯化钠，0.5氯化钾，0.02Na2高压氧化4, 0.04 KH2波4, 1.3 CaCl2, 1.0 MgSO4，和0.4NaH2哥伦比亚3).胚胎是从自然产卵中获得的，并根据《斑马鱼之书》(Westerfield, 2000).在体内成像和原位杂交实验中，在受精后24h加入0.2mm的1-苯基2-硫脲，以防止色素的形成。动物实验是按照遗传和生物分子研究研究所进行的。赫克托恩。“机构审查委员会（动物护理和使用委员会）。除非另有说明，幼虫在5-7dpf时进行检查。在这些年龄

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