中国地方品种和西藏野生大麦中新的Bmy1等位基因的发现提高其b-淀粉酶活性通过MAS提高麦芽品质外文翻译资料

 2023-01-04 11:39:39

中国地方品种和西藏野生大麦中新的Bmy1等位基因的发现提高其b-淀粉酶活性通过MAS提高麦芽品质

原文作者 Xue Gong1,2,4, Sharon Westcott2,3, Xiao-Qi Zhang3, Guijun Yan4, Reg Lance2, Guoping Zhang5, Dongfa Sun1*, Chengdao Li2,3*

单位1.College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan City, China, 2. Department of Agriculture and Food Western Australia, Perth City, Australia, 3.Western Australia State Agricultural Biotechnology Centre, Murdoch University, Perth City, Australia, 4. School of Plant Biology, Faculty of Natural and Agricultural Sciences, The University of Western Australia, Perth City, Australia, 5.Faculty of Agriculture, Life and Environmental Sciences, Zhejiang University, Hangzhou City, China

摘要：我国大麦种质资源丰富，特点不佳，利用不足。在4H染色体上编码beta;-淀粉酶的Bmy1位点具有良好的特性。由于大麦在啤酒酿造业中的重要性，在世界大麦种质资源中得到广泛应用。选择Bmy1位点作为研究基因改良潜力的指标。中国地方品种和西藏野生大麦的麦芽品质研究。采用等位基因特异性多重标记技术对91份大麦种质资源进行遗传多样性评价。八个国家的加入被进一步排序，根据Bmy1在种质中的多重准备标记多样性。8份材料中有6份聚在一起，形成一个独特的群体，并显示出与“Haruna Nijo”相似之处，野生大麦命名PI296896 和lsquo;Ashqelonrsquo;。与已知的Bmy1等位基因进行序列比较，不仅确定了现有的13个氨基酸替换，而且还发现了一个新的替换位点。来自中国地方品种W 127的A387T，具有最高的beta;-淀粉酶活性。根据不同的氨基酸组合，确定了两个新的等位基因/单倍型：Bmy1-Sd1c和Bmy1-Sd5。我们鉴定了C 115，D 165，V 233，S 347和V 430的新氨基酸组合。beta;-淀粉酶活性和氨基酸组成的广泛变化为不同酿造方式下提高麦芽品质提供了新的等位基因，表明其具有很高的潜力。中国地方品种和西藏野生大麦的价值。

介绍

大麦的一个重要的价值用途是麦芽生产麦芽作为酿造啤酒和生产威士忌的原料。根据欧洲酿造惯例，确定麦芽品质，有30多个性状/参数[1]。麦芽和酿造的一个主要过程是将淀粉转化为可发酵的糖。这一过程涉及四种主要酶，包括alpha;-淀粉酶(alpha;-1，4-葡聚糖葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.1）、beta;-淀粉酶（alpha;-1,4-葡聚糖苹果酸水解酶；EC 3.2.1.2）、极限糊精酶（a-糊精果胶6-葡聚糖水解酶；EC 3.2.1.142）和alpha;-葡萄糖苷酶（alpha;-D -葡萄糖苷；欧共体3.2.1.20)[2]。淀粉样酶的联合贡献被称为舒张力(DP)。根据糖化和酿造工艺的不同，对DP的要求可以从低到温和不等到非常高。例如，淀粉辅料在亚洲和北美用来酿造啤酒，因此需要高到非常高的DP来降解多余的淀粉。另一种方法是，当麦芽或利曲酒充分的时候，全麦芽或液体糖在欧洲和澳大利亚被用来生产啤酒时，中度的DP是首选。麦芽品质的新遗传变异一直是酿酒商和育种家关注的目标。在麦芽品质参数中，beta;-淀粉酶是研究和探索最深入的指标，因为它对DP的重要性。该酶由大麦染色体4H[3]端粒区的Bmy1位点编码。Bmy1等位基因的遗传多样性及插入/缺失(Indels)、单核苷酸多态性(SNPs)在蛋白质序列中的Bmy1基因组和氨基酸替换在日本[4]、欧洲[5]、北美[6,7]和澳大利亚[8]的大麦种质中都有很好的特征。Bmy1等位基因的遗传结构决定了beta;-淀粉酶同工酶的类型、活性、热稳定性和酶/抑制剂比[3]。Bmy1的基因组DNA序列有一个5kb的片段，包含3.7kb的编码区和转录起始位点上游1.5kb的DNA序列。该基因包含7个外显子和6个内含子，全长cDNA序列编码535个氨基酸的多肽。到目前为止，Bmy1的7个单倍型被称为Bmy1-Sd1a、Bmy1-Sd1b、Bmy1-Sd2L、Bmy1-Sd2H、Bmy1-Sd2Ha、Bmy1-sd3和bmy1-sd4[5,9]。这些单倍型的形成似乎与生长习性(春季或冬季)、行型(2~6行)和种质地理区域相对应。在从亚洲和中东采集的种质中，大多数单倍型携带BMY1-SD2H和BMY1-SD3和BMY1-SD1B的一些标记。相反，BMY1-SD4单倍型在欧洲占主导地位[5,9]。春大麦品种较易出现Bmy1-Sd1a、Bmy1-Sd2H和Bmy1-Sd2L单倍型，而冬季品种更有可能出现Bmy1-SD4单倍型。Maylesheva-Otto和Roder[5]认为，在115、233和347氨基酸位置的SNP标记足以区分这7种单倍型中的大多数。

中国拥有世界上最大的大麦种质资源，青藏高原被认为是中国本土民族的发源地[10]。然而，到目前为止，对中国大麦种质基因库的了解一直局限于中国地方品种与西藏野生大麦在耐盐性[11]、蛋白质含量等性状上的差异 [12]，对麦芽品质性状的遗传变异没有进行全面的研究[13]。本研究以91个中国地方品种和西藏野生大麦品种为试材，选择Bmy1位点作为研究指标，了解其提高麦芽品质的遗传潜力。我们的结果表明，中国大麦种质资源利用不足，但可能是全球大麦基因库的潜在高度有价值的资源。

材料与方法

植物原料

91份大麦材料最初是从华中农业大学的一批小大麦种质中筛选出来的，其中藏药野生大麦34份，中国地方品种57份(图1，表S1)。这些选线是在位于中国杭州的华家池校园试验场种植的。实验是一个完整的分块设计，有两个副本。选择以色列野生大麦L46(HUA 032)作为对照。在分子多样性研究的基础上，选择了8份大麦种质进行测序。这些参赛作品分别是Z043(早丰一号)、W 127(W84-127)、m279(Maerkangsileng)和野生大麦亚种L35(HUA01)、L47(HUA033)、L48(HUA052)和L68(HUA0640)。

DNA提取与多样性研究

DNA的提取采用与龚如心等人相同的方法[10]。12对多重引物hv1006，hv1010，hv1013，hv1014，hv1015，hv1016，hv1018，hv1019，hv1020，hv1021，hv10。22份，hv1023用于筛选91份材料(表S2)。这些引物的设计是为了识别种质中的Bmy1单倍型。多重引物的应用遵循Hayden等人的协议[14]。条带的出现记为为1，缺席为0。利用SPSS软件对多重准备聚合酶链反应(PCR)筛选的数据进行分析，建立亲本间的关系(图1)。

PCR纯化与克隆

设计了12个配对引物(表S3)来扩增Bmy1基因组序列。引物由GeneWorks(悉尼，新南威尔士)合成。PCR的最终体积为10mL，含1mL 25ng mL-1基因组DNA，1.0mL 10 6pr缓冲液，0.3mL 25 mM Mg2 ，0.4mL 10mMdNTP混合液，3mL甲酚红，1mL 10%PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，1mL 10pmole溶液正反向引物，和0.1mLTaqDNA聚合酶(Invitrogen，德克萨斯州，美国)。对这些引物的PCR条件进行了优化，得到了最佳的PCR结果(表S3)。根据TM的不同，使用两个PCR程序进行PCR扩增。第一个程序包括一个周期94 uC1分钟，61 uC45 s，72 uC1 min，5周期从60uC下降到55uC，每周期降低1uC，然后是25周期94 uC1 min，55 uC30s，72 uC1 min，最后延长72 uC5 min。第二个程序由5个周期组成：94 uC1分钟，62uC45秒，72 uC1分钟，20周期94 uC1分钟，58 uC45s，72 uC1 min，接着为94uC1 min，55 uC30s，72 uC1 min，在72uC下延长5 min。这两个PCR程序是引物特异性的，例如，对于同一对引物，所有8个品种都使用相同的程序。PCR产物在2%份琼脂糖凝胶上进行解析，用溴化乙锭染色。随后用纯化试剂盒(Qiagen)纯化含漱带扩增子。制备最终体积的25mL纯化的PCR产物用于质粒克隆。连接试剂盒（Promega）用于LIG 将目标带加入到pGM-T易向量中.。每个片段都有两个克隆。对BMY 1基因的每个克隆片段和A基因的每个克隆片段进行了双向测序。 应用生物系统双自动DNA测序仪，对每对引物进行测序。模板制备和测序反应按用户手册编写。雷普 在本研究中发现的任何新的核苷酸碱基上进行了ATE实验，以阐明是否有可能出现实验错误。

基因组DNA序列的组装与比对

Bmy1测序和序列比对是用生物编辑软件[15]实现的。一个完整序列的组装和比对过程如下：第一步，对每个克隆片段的59到39和3到59 DNA链沿其整个长度进行测序，以消除阅读和或编辑过程中的错误。使用NCBI BLAST(http://blst.ncbi.nlm.nih.gov)对每个序列的质量进行在线爆破。采用该方法对每对引物扩增的59~39个序列进行了分析。第二步，25美元的Phred质量分数被用于为每个品种组合等位基因。步骤3，8个完整的Bmy1序列和参考Bmy1序列通过集群W分析对齐。 使用默认参数。这一步决定了八个入选文献的异同。另外，一种使用“DNA”的基因树。在Bmy1全序列水平上构建了近邻系统发生树方法。步骤4，八个品种的完整Bmy1序列分别与lsquo;Haruna Nijorsquo;的cDNA序列用于确定cDNA序列，因为lsquo;Haruna Nijorsquo;具有高酶活性和热稳定性的beta;-淀粉酶[8，17]。8份材料的cDNA和通过集群W分析，使用默认参数对参考Bmy1序列进行比对，以识别SNP差异。第5步，第5步，用翻译框架1法将步骤4获得的8个cDNA序列转化为氨基酸序列。

供试材料Bmy 1基因组和氨基酸序列。基因银行提交了mRNA序列和全基因组Bmy1序列，并指定其登录号如下：z 043(KF 302660，KF 302) 668),W127(KF 302661，KF 302669)，m279(KF 302662，KF 302670)，L35(KF 302663，KF 302671)，L46(KF 302664，KF 302672)，L47(KF 302665，KF 302673)，L48(KF 302666，KF 302674)和L68(KF 302667，KF 302675).来自基因库的19个代表Bmy1SNP和单倍型的材料：Morex(EU589328)，Harrington(FJ 161079)，HA52(AJ 301645)，Strider(EU589327)，Harun Nijo(D21349)，Pi296897(AF061204)，AB75(TremL P82993)，Adorra(AF 061203)，Hiproly(X 52321)，Steptoe(EF 175470)，Orca(EF 175468)，Legacy(FJ 161080)，Stander(EF 175469)，Tango(EF 175471)，UC 958(EF 175472)，UC 960(EF 175473)，Schooner(AF 300799)，Franklin(AF 300800)和Ashqelon(FJ 161078)。

beta;-淀粉酶活性测定及统计学检验

beta;-淀粉酶活性用文献[17]中的协议进行测定，但根据beta;-淀粉酶试剂盒(Megazyme International，爱尔兰有限公司)的说明进行了相应的修改。每个测量都是连续的一式三份。最终的b-淀粉酶活性被定义为Ug-1。在GenStat(版本14)中进行了邓肯多程试验，以比较样品间酶活性的差异。

结果

利用INDELS筛选Bmy1多样性

在准备多重PCR标记的开发从INDELS分91份材料分为两个大组。1组16份，2组75份。在1组，二棱野生大麦聚集在一起，六行本地种族聚集在一起(表S1，图1)。第2类群种质的分布并不表现为分布在地方品种间的野生大麦的特殊格局。各大组也观察到大量的小群体。基于INDELS分类Bmy1内含子和启动子序列，以及以前的遗传多样性研究利用相同的材料[10]，进一步选择8个材料进行酶活性分析，并对完整的Bmy1序列进行序列分析。

Bmy1cDNA和氨基酸多态性

在序列中鉴定出二十一个SNP，共产生13个氨基酸替换(表1)。氨基酸T387A在中国地方品种W 127中具有特异性，是由该基因经1159TRAlt;

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