大豆中钙依赖性蛋白激酶的全基因组鉴定及其对草食昆虫和干旱胁迫的转录反应分析外文翻译资料

 2023-01-07 15:42:31

大豆中钙依赖性蛋白激酶的全基因组鉴定及其对草食昆虫和干旱胁迫的转录反应分析

Christian Hettenhausen*, Guiling Sun*, Yanbiao He, Huifu Zhuang, Ting Sun, Jinfeng Qi amp; Jianqiang Wu

摘要：钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）是植物特有的钙传感器，在植物生理学的各个方面都发挥着重要作用。在这里，我们研究了大豆（Glycine max）GmCDPKs的系统发生关系，染色体位置，基因结构以及组织特异性，昆虫啃食和干旱诱导的表达谱。鉴定出五十个GmCDPK基因，它们在系统发育上分为4个大的家族和13个亚族。GmCDPKs的单个类别具有高度保守的mRNA剪接位点，其外显子数量和长度与系统发育关系一致，这表明在单子叶植物和双子叶植物分离之前至少出现了13个祖先CDPK基因。基因表达分析表明几种GmCDPKs是组织特异性表达的。GmCDPKs的转录水平在受伤后发生变化，通过模拟甜菜夜蛾啃食或大豆蚜虫（Aphis glycines）摄食后，发现GmCDPKs表现出特异的表达模式，并且基本与植物激素茉莉酸和水杨酸无关。在干旱和脱落酸处理后，GmCDPKs的转录反应最为显著，超过一半的GmCDPKs上调，表明它们在大豆非生物胁迫反应中发挥着重要作用。我们的研究结果为进一步分析GmCDPKs在大豆-昆虫相互作用和干旱胁迫适应的背景下的功能奠定了基础。

Ca2 是一种广泛存在的第二信使，它通过激活各种细胞过程来响应发育和胁迫刺激[1-3]，在真核生物信号转导中起关键作用。在植物中，细胞质中瞬时Ca2 变化由一系列钙传感器（例如钙调素，钙调素结合蛋白，类钙调神经磷酸酶B蛋白和钙依赖性蛋白激酶(CDPKs或CPKs) 感应和解码，然后这些传感器进一步与其下游靶蛋白相互作用，进而触发Ca2 标记特异性反应。

人们在植物和一些原生动物中发现了CDPKs，但在动物或真菌中还没有发现它们。典型的CDPK由5个结构域组成(你的综述中写的4个结构域)：可变的N末端结构域、蛋白激酶结构域、自抑制连接结构域、钙调蛋白样结构域和c末端结构域。N末端结构域在CDPKs中显示出最高的序列差异，并且通常包含被认为与亚细胞靶向相关的肉豆蔻酰化或棕榈酰化位点[4]。蛋白激酶结构域是具有ATP结合位点的催化结构域，与自抑制连接结构域[5]和连续的钙调蛋白样结构域相邻，其中包含钙离子结合的EF-hands结构[4]。C末端结构域也是可变的，而且不同CDPKs之间长度和氨基酸组成不同。有人认为，N和C末端可变域决定了单个CDPK的特定功能[6]。Ca2 与钙调蛋白结构域的结合导致构象变化，继而将自抑制域与激酶结构域置换，从而激活CDPKs。

最近的发现指出CDPKs在植物应对伤害和昆虫啃食时发挥作用。玉米(Zea mays) ZmCDPK11的表达和酶活性在伤害、亚麻酸和茉莉酸甲酯(MeJA)的作用下上调，而伤害诱导的ZmCPK11的激活依赖于磷脂酶D (PLD)通路中产生的磷脂酸[7,8]。拟南芥AtCPK3和AtCPK13使转录因子HsfB2a磷酸化，HsfB2a反过来调控几个与夜蛾取食后相关的胁迫基因的转录表达[9]。番茄(Solanum lycopersicum) LeCPK1抑制质膜H -ATP酶诱导胞外碱化，以作为伤口和病原体防御信号级联的一部分[10]，而LeCDPK2在损伤反应中磷酸化LeACS2，通过直接磷酸化稳定这个限速酶，使其稳定乙烯(ET)生物合成[11]。此外，Zhang等研究表明，酿酒葡萄用ET处理后，一些CDPKs基因的表达增加[12]，从而抑制了NaCDPK4和NaCDPK5表达，大大提高葡萄对传粉夜蛾啃食的抗性[13,14]。

干旱胁迫是植物面临的另一个主要威胁，最近的研究表明CDPKs在调节植物的耐旱性中发挥着重要作用。玉米幼苗受到干旱胁迫后，ZmCPK12高度诱导，在拟南芥中过表达ZmCPK12可以提高拟南芥在干旱条件下的存活率[15]。同样，胡杨PeCPK10在拟南芥中过表达也提高了拟南芥的耐旱性，并增强了几种ABA响应基因的表达[16]。OsCPK9和OsCDPK7正向调控水稻对干旱胁迫的耐受性，这可能是通过影响ABA和胁迫应答基因的转录水平来实现的[17,18]。重要的是，保卫细胞表达的拟南芥CPK21被鉴定为保卫细胞阴离子通道SLAC1的主要相互作用伴侣，从而调节气孔ABA信号转导[19]。

CDPKs在高等植物中是一个庞大的家族，在拟南芥、玉米、水稻(Oryza sativa)、杨树(Populus trichocarpa)和小麦(Triticum aestivum)中分别发现了34、35、31、30和26个CDPK基因[20-23]。大豆(Glycine max)是世界上最重要的农作物之一，为人类和牲畜提供油脂和蛋白质。Valmonte等人从大豆中鉴定出47个CDPK基因，并揭示了其中的广泛序列保守性[24]。大豆CDPKalpha;和CDPKgamma;使氧化应激后参与半胱氨酸生物合成的丝氨酸乙酰基转移酶磷酸化[25]。在大豆根瘤中，某些CDPKs使膜蛋白nodulin-26磷酸化，从而影响其电压敏感通道的活性[26]。nodulin-100是一种蔗糖合酶，它能分解蔗糖，为根瘤C / N代谢提供能量[27,28]。然而，关于GmCDPK在大豆发育，生长以及对生物和非生物胁迫的适应性方面的作用还知之甚少。

在这项研究中，我们进行了全基因组分析，并鉴定出50个GmCDPK。对它们进行了系统进化分析，比较了GmCDPKs的基因结构，揭示了它们的进化关系。 此外，我们检查了所有GmCDPKs的表达，包括机械损伤、拟甜菜夜蛾和大豆蚜虫的啃食、JA，ET和SA处理，发现植物激素对植物防御昆虫以及对干旱和ABA的响应都很重要。 我们也发现，许多GmCDPK的转录水平不依赖于JA或SA信号传导，而是根据不同的昆虫啃食有特异性的改变，这表明GmCDPK可能在大豆对昆虫的防御中起重要作用。 此外，几乎80％GmCDPKs是在干旱或ABA处理后诱导表达的，凸显了它们在调节干旱胁迫反应中的重要作用。

结果

GmCDPK基因的鉴定和特征。

为了找到大豆中所有的CDPK，我们对大豆基因组中的所有预测蛋白质进行了结构域搜索（http://www.phytozome.net/soybean）。总共鉴定出68种含有蛋白激酶结构域和至少一个EF-hands结构域的蛋白质，其中5种与CRK，CaMK和CCaMK具有高度相似性，因此被淘汰，其余蛋白质称为GmCDPKs。使用这些GmCDPK作为对基因组草图和预测的mRNA的查询，进行了进一步的数据库搜索，未发现其他结果。根据它们在大豆染色体上的位置，将总共来自50个基因位点的63种蛋白质（包括可变剪接形式）鉴定为GmCDPKs，其编码基因被命名为GmCDPK1至GmCDPK50（补充表S1）。 GmCDPK1，GmCDPK9，GmCDPK35和GmCDPK46中的可变剪接区域包含EF-hand结构域，导致蛋白质同工型的EF-hands少于4个（补充表S1）。 GmCDPK50在5端缺少600 bp，通常是可变的N端结构域和一部分蛋白激酶结构域。我们检查了5基因间区域（约4 kb），未发现编码保守蛋白激酶结构域的任何片段。这些发现强烈表明GmCDPK50是假基因。

CDPKs N末端的肉豆蔻酰化和棕榈酰化与其亚细胞定位和底物特异性相关[29-31]。 63个GmCDPK蛋白中有49个具有豆蔻酰化位点，除了GmCDPK2，GmCDPK38和GmCDPK41以外，均位于前32个氨基酸中。 63种GmCDPK蛋白中有7种没有棕榈酰化位点。 大多数棕榈酰化位点位于前7个氨基酸内，尽管其中有7个GmCDPKs被预测位于N端的第50个氨基酸附近（补充表S1）。 我们使用TargetP和NucPred32进一步预测了细胞器的特异性定位，发现10个GmCDPKs定位于叶绿体中，其中GmCDPK29和GmCDPK49这两个包含有线粒体特异性靶向序列（补充表S1）。 GmCDPK37.2和GmCDPK41推测定位于细胞核中。

系统发育关系，基因结构和潜在的功能差异的GmCDPKs。

为了深入了解GmCDPKs的进化过程，我们还使用相同的方法从其他两个豆科植物百脉根和蒺藜苜蓿中鉴定了CDPK基因，分别发现了19和25个CDPK基因（补充表S2）。构建了包括这三种豆科植物，拟南芥和水稻的所有CDPKs的最大进化树（图1）。系统发育分析表明，这5个物种的所有CDPKs分为4个大族（图1，族I–IV），这与先前的报道一致[20,24,33]，。研究发现，CDPKs分布在13个子家族中（图1，用棕色圆点表示），每个子家族都包含来自双子叶植物和单子叶植物的CDPKs。因此，在双子叶植物和单子叶植物分化之前至少存在13个祖先CDPK基因。至于这3个豆科物种，在13个亚类中有9个（图1，蓝色背景）含有至少2个百脉根和蒺藜苜蓿的旁系CDPK和4个大豆的旁系同源物。这9个亚类中的旁系同源物可能是由于在豆类的共同祖先中发生的基因组复制事件以及随后在大豆中独立发生的基因组复制而引起的[34]。值得注意的是，GmCDPK25在I族中成簇聚集，而GmCDPK37 / 41/42在II族中三个聚集（图1和补充图S1），这表明基因组复制事件后可能已经发生了基因丢失。

为了使系统发育关系与GmCDPK基因结构的模式相关联，我们分析了GmCDPKs的内含子-外显子特征。尽管内含子的长度是可变的，但所有13个亚类中的外显子数量和长度均与其系统发育关系一致（补充图S1）。 所有内含子的中位长度为265 bp，在GmCDPK41中最小为31 bp，在GmCDPK6中最大为4168 bp。I-III家族中的大多数GmCDPKs具有6至9个外显子，而IV家族中的GmCDPKs具有12或14个外显子。 IV家族 中GmCDPKs的复杂基因结构表明其与其他GmCDPKs具有不同的进化历史和可能的功能差异。

GmCDPKs的染色体分布和与发育相关的表达谱。

大豆在进化中上至少发生了两次基因组复制事件，随后发生了许多染色体重排，基因结构多样化和众多基因丢失，这些事件导致了相当复杂的基因家族。在20条染色体中，第9、13和15条染色体不携带GmCDPKs，第12和16条染色体仅包含1个GmCDPK基因，第2条和第10条染色体各自包含6个GmCDPK基因，所有其他染色体均具有2-4个GmCDPKs（图2）。除GmCDPK26外，所有GmCDPK都位于染色体末端，与大豆基因组测序数据一致：预计约78％的大豆基因位于这些区域[34]。至少有7个片段重复有助于GmCDPK基因家族的扩展（图2和补充图S1）。例如，在染色体1上，GmCDPK1与GmCDPK2相邻，在染色体11上，GmCDPK31与GmCDPK30接近；GmCDPK1和GmCDPK31都是旁系同源物，GmCDPK2和GmCDPK30也是如此（图2）。检查单个CDPKs之间的基因显示出两个染色体区域之间具有高度的相似性，表明它们源自片段重复。另一例与10号染色体和20号染色体相关：据报道，10号染色体和20号染色体的长臂很可能源自片段重复[34]。支持这种情况的是，第10号染色体上的GmCDPK28和第20号染色体上的GmCDPK49显示了高序列同一性，它们各自的相邻基因GmCDPK29和GmCDPK50也是如此（图2和补充图S2）。染色体17上GmCDPK41和GmCDPK42lt;

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