Nup96和HOS1相互稳定，并调节CONSTANS蛋白水平从而调控拟南芥在长光照下开花[CC-BY]外文翻译资料

 2023-01-07 15:43:10

Nup96和HOS1相互稳定，并调节CONSTANS蛋白水平从而调控拟南芥在长光照下开花[CC-BY]

摘要：核孔复合体深刻地影响开花的时间；然而，人们对其基本机制知之甚少。本文报道了 Nucleoporin96 (Nup96)在拟南芥(Arabidopsis thaliana)的长光照周期开花过程中起负调控作用。通过多种途径，我们鉴定了HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENE1 (HOS1)的E3泛素连接酶高表达，并证实了其与Nup96在体内的相互作用。Nup96和HOS1主要定位在核膜上并相互作用。Nup96功能的丧失导致HOS1蛋白的破坏，而其mRNA丰度没有改变，这导致长光照周期开花的关键激活因子CONSTANS (CO)蛋白的过度积累，正如之前在HOS1突变体中报道的那样。出人意料的是，HOS1的突变显著降低了Nup96蛋白水平，这表明Nup96和HOS1相互稳定，从而形成了一个新的抑制模块，调节CO蛋白的转换。因此，nup96单突变体、hos1单突变体和nup96 hos1双突变体具有高度相似的早花表型和重叠的转录组变化。同时，本研究揭示了一种抑制机制，通过Nup96-HOS1抑制模块抑制CO蛋白的水平，从而阻止长光照条件下的早熟开花。

1.引言

植物已经进化出感知各种环境信号的能力，如季节白昼长度和温度变化，这些决定了成功繁殖的最佳开花时间(Michaels，2009；de Montaigu等，2010；Jarillo和Pintilde;eiro，2011)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中，主要的白昼感知的分子机制包括昼夜时钟控制的转录和蛋白酶体依赖的转录因子CONSTANS (CO)的蛋白降解。通过这些机制，CO蛋白被限制在长时间的黄昏积累(Samach 等，2000；Valverde等，2004；Shim等人，2017)。积累的CO蛋白直接激活成花基因FLOWERING LOCUS T(FT)在叶中的转录，其编码蛋白被运输到叶尖，进而诱导花分生组织特性基因的表达，如APETALA1 和LEAFY，启动花原基的形成(Weigel等，1992；Abe等，2005；Wigge等，2005)。CO的转录受到多种正负调节因子的严格控制。两组不同的转录因子FLOWERING BHLH (FBH)和TEOSINTE BRANCHED1/ CYCLOIDEA/PROLIFERATING CELL NUCLEAR ANTIGEN FACTOR (TCP)，是通过直接与CO启动子结合而成为CO的激活因子(Ito等，2012；Kubota等，2017)。FBH1和TCP4都与另一个CO基因激活因子GIGANTEA（GI）会发生作用 (Koornneef等，1998；Suaacute;rez-Loacute;pez等，2001；Kubota等，2017)，但FBH1和TCP4对GI的功能依赖性不同。TCP4以GI依赖的方式激活CO，而FBH1部分独立于GI激活CO (Kubota 等，2017)。CO的表达也可以被CYCLING DOF FACTOR蛋白所抑制，DOF因子蛋白能够结合CO启动子中的DOF结合位点(Imaizumi 等，2005；Fornara等，2009)。除了转录调控外，CO的翻译后调控对测定白昼长度也至关重要。CO蛋白翻译后的最佳调控是蛋白酶体依赖的降解，它利用不同的E3泛素连接酶。E3连接酶CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC1 (COP1) 与phyA-105抑制因子结合，在黑暗中特异性降解CO蛋白 (Jang等，2008)。而另一种E3连接酶HIGH EXPRESSION OF OSMOTICALLY RESPONSIVE GENE1 (HOS1)介导了长白天早晨CO的降解(Jung等， 2012；Lazaro等，2012)。其他机制也涉及到CO蛋白的直接稳定(Song等，2012， 2014)。

尽管目前已经鉴定出了许多调节开花时间的基因，但其中许多基因的潜在分子机制尚不清楚。一个例子是一组核孔相关蛋白质。核孔复合物嵌在核包膜中，是核与细胞质之间的物理屏障，是核质转运大分子的唯一通道(i.e.，proteins and RNAs；Meier和Brkljacic，2009； Wauml;lde和Kehlenbach，2010)。核孔复合物由30种不同的核孔蛋白(Nups)的多个副本组成，这些核孔蛋白形成几个亚复合物(Tran和Wente，2006；Strambio-De-Castillia等，2010)。在拟南芥中，迄今为止大多数Nups已经通过遗传和生化方法被鉴定出来(Tamura等，2010)，其中一些被报道参与各种重要的发育和抗性过程。Mutations of Nup136 (也称Nup1)，Nup160 (也称 SUPPRESSOR OF AUXIN RESISTANCE1 [SAR1])，Nup96(SAR3 or MODIFIER OF SNC1，3 [MOS3])和AtTPR (Arabi-dopsis thaliana TRANSLOCATED PROMOTER REGION，也称 NUCLEAR PORE ANCHOR)显著促进植物开花(Zhang和Li， 2005；Parry等，2006；Jacob等，2007；Xu等，2007；Tamura等，2010；Parry，2014)，而缺Nup62、Nup58和Nup54基因功能的植物则表现出中度早开花表型(Zhao和Meier， 2011；Parry，2014；Boeglin等，2016)。此外，部分分布在核膜上的蛋白质功能的丧失也会导致植物开花时间的改变。例如，the low expression of osmotically responsive genes4 (Gong等，2005)，early in short days4(Murtas等，2003)，和hos1 (Jung等，2012，2013；Lazaro 等，2012)突变体表现出早开花表型。这一发现有力地证明了核孔相关蛋白在拟南芥开花时间的调控中发挥着重要作用。然而，到目前为止，还没有详细的证据来证实Nups调控开花的潜在分子机制。

在这项研究中，我们发现拟南芥核孔复合体的一个组成部分Nup96负调控着拟南芥的开花过程。通过结合蛋白质组学方法和蛋白质相互作用分析，我们证明开花抑制因子HOS1 E3连接酶在体内的核膜上与Nup96结合。Nup96功能的丧失导致了HOS1蛋白的破坏，这导致了开花期的nup96单突变体、hos1单突变体和nup96 hos1双突变体的表型不变。正如之前在hos1突变体中报道的那样(Lazaro等，2012)，nup96突变体的早期开花在很大程度上可以解释为CO蛋白的过度积累。此外，本研究还观察到hos1突变体中Nup96蛋白水平意外下降。这些结果揭示了一种相互稳定的Nup96-HOS1抑制复合体负调控CO丰度并阻止拟南芥在长日照条件下提前开花的机制。

2.成果

2.1 Nup96是拟南芥开花的负调控因子

在人类细胞中，Nup96和Nup98被编码为一个融合基因，合成为186-kD前体蛋白。该前体的自蛋白裂解释放出两种成熟的核孔蛋白Nup96和Nup98 (Fontoura等，1999)。而拟南芥的Nup96(SAR3/MOS3，At1g80680)和nup98 (Nup98a，At1g10390；Nup98b，At1g59660)基因位于基因组的不同位点，并单独合成成蛋白质(Zhang和 Li，2005；Parry等，2006；Tamura等，2010)。值得注意的是，在拟南芥的Nup96和Nup98蛋白中都保留了保守的自蛋白水解过程域(APD)(图1A)。大多数植物的Nup96蛋白的结构与拟南芥的Nup96蛋白具有保守的APD(补充图；补充数据集1)，这表明Nup96基因在植物和动物谱系中各自独立地多样化。之前对Nup96在拟南芥中的特性研究表明其在生长素信号和免疫应答中的重要作用(Zhang 和 Li，2005；Parry等，2006)；虽然观察表明nup96突变导致植物早开花(Parry等，2006)，但潜在的分子机制尚不清楚。

为了解决这个问题，我们首先对两个突变等位基因nup96-1 (SALK_109959，也被称为sar3-3或mos3-2；Zhang和 Li，2005；Parry等，2006)和nup96-2 (SALK_117966，也被称为mos3-3；Zhang和Li，2005；图1B)在不同实验条件下。通过RT-PCR和免疫沉淀(IP)分析，我们验证了这两个等位基因都是无效的，因为没有检测到全长Nup96转录本和蛋白(图1C和1D)。当Nup96 -1和Nup96 -2在长日或短日条件下生长时，它们的开花时间都比野生型植物早得多(图1B和1E)，这表明Nup96负调控拟南芥的开花过渡。我们还注意到nup96突变体在长日比短日开花更早，这表明nup96突变体对植物对日照变化的敏感性影响有限。接下来，，我们观察到的互补与早期开花的表现型(图1F和1G)，当用花椰菜花叶病毒35S启动子驱动的Nup96 cDNA或在Nup96编码序列上游2.5 kb启动子驱动的Nup96-GFP融合基因转化Nup96- 1植物时，可以产生正常的Nup96蛋白(图1H)。这一发现证实了nup96突变体的早期开花确实是由于nup96功能的丧失。

2.2 Nup96开花活动不需要进化保守的自蛋白水解过程

考虑到Nup96蛋白保守的裂解位点位于N端(Fontoura等，1999；Iwamoto等，2010)，我们想知道这

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