斑马鱼转基因细菌人工染色体的改良外文翻译资料

 2023-01-07 15:44:25

斑马鱼转基因细菌人工染色体的改良

摘要：转基因操作利用细菌人工染色体(BAC)提供更高的精确度来指导外源基因的理想表达，该技术应用于光学透明 斑马鱼中并与荧光蛋白标记技术一起，能为视觉分析基因在生物体内的表达调控带来极大的无法比拟的优势。在这里，我们描述了一个简化的程序，在斑马鱼体内直接选择多个BAC 克 隆的公共序列数据库，然后快速修改与GFP或RFP用于转基因分析。 主 要 经 历 细菌人工染色体DNA的制备、斑马鱼胚胎显微注射和转基因斑马鱼携带GFP/RFP 修 饰 BAC克隆的筛选实验过程。

关键词：转基因斑马鱼；GFP；RFP；修饰基因；斑马鱼BAC和PAC

1.导言

斑马鱼是一种极好的模型生物，它提供了一个独特的机会来整合经典遗传学、实验胚胎学、功能基因组学和分子生物学的工具，以了解脊椎动物的发育。 此外，斑马鱼基因组测序项目即将完成。 我们面临的挑战是了解脊椎动物基因组中通常包含的3万多个基因的表达、调控和功能。 目前，涉及整个RNA原位杂交， 利用质粒标记基因和经典遗传学的转基因方法是解决斑马鱼和其他生物中这些基本问题的普遍工具。 在表达分析方面，整个RNA原位杂交缺乏分辨率，需要对胚胎进行改造，而目前的转基因技术通常基因调控序列数量不够而且缺乏准确性，无法准确重述内源性基因的表达模式。

在各种生物中获得的许多例子表明，细菌人工染色体(BAC)转基因可以是一种更有力的方法来指导转基因的表达。 BACs是一种克隆载体，可以容纳多达300kb 的大型基因组DNA插入。 在大多数情况下，BAC转基因结构可以比较小的插入载体更好地指导转基因表达，因为它们可以包括跨越几十或数百千基的远端调控序列[6,7]. 在过去的几年里，已经建立了几种基于同源重组的修饰BACs的方法，允许在精确的位置将转基因插入到大的DNA 片段中[8–10] 。 我们以前使用了一种高效的方法来修饰BACs，对小鼠神经元基因的表达进行

高通量转基因研究[11]。 同时，我们在斑马鱼中试验了这种方法，修饰了100多个BAC克隆，用于不同的斑马鱼基因。本章介绍了根据基因组序列选择BAC克隆，在大肠杆菌中通过基因修饰，将GFP或RFP插入BACs，并通过在 受精卵中显微注射修饰过的BAC DNA 生成转基因斑马鱼的详细程序。

2.鉴定含有目的基因的BAC克隆

斑马鱼基因组BAC文库CHORI-211是桑格研究所斑马鱼 基 因 组 测 序 项 目 中 使 用 的 BAC 文 库 之 一.我们的重点是如何从这个基因组文库选择理想的BAC克隆，因为许多实验室已经能自行获取，个别克隆可从BACPC资源提供中心购买。来自cDNA或部分基 因组片段的目的基因的序列被用来“ 进行爆炸性搜索”，使用斑马鱼基因组的最新组装。 在编写本章时 ， 当 前 的 程 序 集 是 斑 马 鱼 的 Zv5 数 据库。叠连群视图被选中以显示基因在重叠群上的位置。 然后，在“装饰”的下拉菜单中选择“BAC结束”并扩展序列区域以覆盖整个序列或在“跳转到区域”处的 单个连体的大约400kb之后，通过刷新网页来识别相应基因的克隆名称或BAC的ID编号”。 如果没有发现直接覆盖该基因的BAC克隆，则可以选择几个附近的BAC克隆，其末端位于靶基因的200kb以内，进行PCR分析。 一旦确定，含有目的基因的BAC克隆可以用于进一步的修饰。

如果克隆名称可用，它们可以用作登录号来搜索克隆状态数据库。这允许用户从CHORI-211库中识别BAC的ID号。 如果通过此搜索的BAC克隆被证实不是来自CHORI-211库，则可以使用斑马鱼BAC fpc数据库进行更深入的线上研究。这样的第二次搜索通常允许识别额外的CHORI-211 BAC 克隆对应的目的基因，若是没有，来自CHORI-73、DKEYP或DKEY库的BAC克隆也可以直接用于修饰。在爆炸性视图窗口中，在每个基因的ATG起始密码子上游选择大约1kb的基因组序列，并选择“导出序列”来设计PCR引物。用引物特异性地对该基因进行PCR连接，以获得所需的BAC。 到目前为止，我们已经能够获得约80%的需要修改的CHORI-211 BAC基因的克隆。

3.通过插入GFP、RFP报告基因或其他转基因来修饰BAC

3.1.BAC的引物设计及A盒的构建

为了获得相应BAC克隆的PCR结果，设计了两个引物(引物A3R和A5Asc）引物A3R，即3rsquo;反向引物，位于目的基因的ATG 起始密码子附近的5rsquo; 端。 Primer A5Asc，是5rsquo;正向引物，位于反向引物上游300-500bp，包含AscI限制性位点的序列。 这个PCR片段被命名为“A 盒”，用于基因修饰过程，而BAC上相应的基因组序列被称为“Arsquo;盒”。 另一个5rsquo;正向引物(引物A5F)位于Arsquo;盒外和上游约100bp，用于检测BAC克隆同源重组后的特异性。

3.2.具有GFP/RFP报告基因的斑马鱼BAC克隆的修饰

我们已经成功地用包括GFP、RFP和癌基因在内的多个转基因修饰了BAC 克隆。在这里， 我们以GFP/ RFP作为例子来描述这个过程。

3.2.1.携带GFP/RFP报告基因的靶向载体的构建

用上述引物从靶向基因的BAC基因组序列中扩增出PCR片段(300-500bp)，用AscI消化，并连接到靶向载体pLD53.SC2 [9,10] 它包含GFP或RFP，并预先消化限制性内切酶Ascl和Smal。因此，PCR片段位于GFP或RFP报告基因的上游，为重组提供了同源的区域。 靶向 载 体 携 带 的 A 盒转化为与复制起源兼容的pir2细胞，R6K4和DNA，然后使用类似试剂盒的高速大规模生产工具进行制备。

图注：从CHROI-211文库中鉴定相应BAC克隆的流程图。目的基因的cDNA序列通常是可用的，或者可以从搜索ZFIN和NCBI数据库中获得。 然后从桑格研究所、UCSC、ZFIN和NCBI的网站上获得这些基因的基因组序列。 在某些情况下，目的基因的基因组序列可以直接从网站上通过搜索基因的名称获得。 基因分布在染色体上合适的位置， 重要支架和组块是从桑格研究所网站获得的。

通过使用cDNA序列执行Blast/SSAHA搜索。 如本文所述，通过选择“ContigView”，然后在“装饰”的下拉菜单中检查“BAC 结束”，获得位于目的基因周围区域的相应BAC克隆或BAC末端”。 然后从CHORI-211库中选择相应的BAC克隆。 使用克隆名称作为登录号码， 通过搜索克隆状态数据库获得BAC克隆。 在从CHORI-211库以外的库中找到BAC克隆的情况下，可以通过搜索斑马鱼基因组指纹项目数据库来获得相应的CHORI-211 BAC 。

3.2.2.转化RecA质粒

将含有细菌RecA基因的质粒转化为原始BAC宿主细胞，瞬时表达RecA酶，促进同源重组。 该质粒携带一个四环素抗性基因和一个复制时候对温度敏感的来源，并按照大肠杆菌细胞的小规模培养协议制备， 方法是在30°C下在含有5mg/ml四环素的LB培养基中生长。将含有靶向BAC克隆的大肠杆菌细胞接种到4mlLB培养基中，在37°C下摇床孵育。 当OD值达到0.3-0.5和大肠杆菌收集到两个离心管时，将4毫升培养液在冰上冷冻至少10分钟。 将大肠杆菌细胞收集在2个Eppendorf管(1.5ml)中，在4°C下离心，5500r pm离心10min。 每个Ep管中的细胞用1.5毫升冰凉的50mMCaCl重新悬浮, 溶液放置在冰上孵育5分钟。在相同条件下再次离心后，将细胞结合并悬浮于150micro;l冰凉50mCaCl中2 含有10%甘油的溶液，加入3个预冷Ep管。 然后将一个质粒DNA(2-3micro;l)加入到其中一个样品中，在冰上孵育30分钟。 在42°C下摇床90s后，加入800micro;l SOC培养基，细胞在37°C下孵育，在225 转/分下摇动1小时。大肠杆菌细胞扩散到含有氯霉素(25mg/ml)和 四环素(5mg/ml)的LB/琼脂平板上，在30°C下孵育过夜。 试 样 中 额 外 的活性细胞可以储存在－80°C。

图解：斑马鱼BAC克隆的修饰。 （1）PCR扩增得到目标基因翻译的5rsquo;起始密码子相邻的基因组序列片段，并连接到目标载体中。 PCR片段位于GFP报告基因的上游。 （ 2 ） 携带RecA基因的质粒转化为BAC宿主细胞。 该质粒含有四环素抗性基因(Tet) 和复制时对温度敏感的起源(T)。 （ 3 ） 将携带GFP 和A盒的靶向载体通过电穿孔导入含有BAC克隆和RecA质粒的大肠杆菌细胞。 随着RecA的瞬时表达，A盒和A盒之间发生同源重组。 （ 4 ） 通过同源重组，将靶向载体整合到BAC克隆中。 用抗生素氯霉素和氨苄西林双重筛选修饰过的BACs。 黑盒：靶基因的编码区；开盒：UTR；灰盒：靶向载体中的片段或BAC中插入的Arsquo;盒；(T)：RecA质粒复制时对温度敏感起源。

3.2.3.修 饰 的 BAC克隆的同源重组和鉴定

将含有靶向BAC克隆和RecA质粒的大肠杆菌细胞接种到2mlLB中，用氯霉素(25mg/ml)和四环素(5mg/ml)接种，在30°C下摇床孵育一夜。 将一毫升过夜的LB培养物转移到100毫升LB中，用相同的抗生素，在30°C下培养，300转/分钟摇动。 当OD值达到0.5-0.7时，将100 毫升培养液在冰上冷冻至少15分钟，并通过离心收集大肠杆菌细胞。 细胞重新悬浮在100毫升冰冷的10%甘油中，再离心。 此清洗步骤在将大肠杆菌细胞放在200micro; l10%甘油中重新悬浮之前重复一次。 一个40micro;l的试样被转移到一个预先填充的1.5毫升大小Eppendorf管中，并与2micro;l 预先制作的靶向载体（1micro;g DNA）混合。然后用电穿孔预成型搬运器2510(Brinkmann仪器)与1毫米小杯(Brinkmann仪器)。 1800KV时形成预成型的大肠杆菌细胞，然后与1毫升SOC培养基混合并转移到细菌培养管中。 在37°C下225转每分钟摇床孵育1h，用5500 转/分离心5分钟收集细胞，转移到含有氯霉素（25毫克/毫升)、氨苄西林(50毫克/毫升)和四环素(5毫克/ 毫升）的5毫升LB 培养基中，然后在30°C下孵育，300 转/分摇动过夜。将10、50和100micro;l大肠杆菌细胞试样扩散到含有氯霉素(25mg/ml)和氨苄西林(50mg/ml)的LB/琼脂平板上，在43°C下孵育过夜。

随着RecA蛋白的瞬时表达，靶向载体的A盒之间和BAC克隆中的Arsquo;盒之间可能发生同源重组。 因此，靶向载体整合到BAC克隆中的一个精确位置，GFP/RFP报 告基因处于修饰BAC中包含的调控元件的控制之下。由于TS ori，Rec A质粒随后通过高温(43°C)孵育而被消除。

为了筛选正确的修饰BAC克隆，PCR是用引物A5F 和 GFP(5rsquo;-GCTGCTTCATGTGTGGTCGGGGTA－3rsquo;) 或RFP(5rsquo;-AAGTTCATCAGCCCCTACTGCC－3rsquo;）反向引物

预先形成的。DNA来自于PCR鉴定出来的修饰BAC 菌 落 ， 此外 还 有 原 始 的未修饰BAC克隆，是用标准的微型制剂制备的，并与NotI/SalI或NotI/BamHI双重消化。 用脉冲-焊接电泳分析了修饰BAC和原始未修饰BAC的消化模式。我们目前使用FIG Mapper 电泳系统(Bio-Rad) ， 在0.25*TAE中运行1%琼脂糖凝胶约16h，并使用以下程序。

正向 反向

电压(v) 180 120

初始开关时间s 0.1 0.1

最终切换时间s 0.4 0.4

Ramp 50%线性 50%线性

在N o t I/SalI 消化的情况下， 从最初的未修饰BAC的DNA的分解片段中提取的一条带预计将比修饰过的BAC的DNA 增加约3.5kb， 而所有其他带应保持不变。 当用Not I/BamHI消化时，应该有两个新的带，而与原始BAC相比，修饰BAC的DNA中没有一个原始带。两个新波段的总尺寸应比对应的未修饰BAC联结大3.5kb。这个差异对应于整合的靶向载体的大小。 可以通过使用A 盒上游的正向引物进行测序来保证整合的准确性。 在我们的研究中， 同源重组的效率在在15%到100%之间。

图解：修饰BAC克隆的鉴定。 原始的未修饰BACs和修饰BACs都用NotI/SalI进行双消化，并通过脉冲-焊接凝胶电泳分离。 在正确的修饰之后，原始BAC的DNA中存在的一个消化带预计将在修饰BAC DNA中向上移动约3.5kb，这就是整合进去的靶向载体的大小。

4.用修饰BACs生成转基因斑马鱼

4.1.提取修饰BACDNA

用于制备GFP和RFP基因修饰过的BAC DNA，单个含有修饰BAC的大肠杆菌菌落从含有相同抗生素的LB平板接种到含有氨苄西林(50micro;g/ml)和氯霉素(25micro;

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