锦灯笼超临界萃取物抗氧化 和抗炎活性的研究外文翻译资料

 2023-01-10 16:14:18

锦灯笼超临界萃取物抗氧化

和抗炎活性的研究

原文作者 S.J.Wu,J.Y.Tsai,S.P.Chang,D.L.Lin ,S.S.Wang,S.N.Huang ,L.T.Ng

摘要：本研究采用超临界二氧化碳 (SFE-CO2) 方法对民间常用药——锦灯笼进行提取，得到 SCEPP-0、 SCEPP-4 和 SCEPP-5 3种萃取物。以锦灯笼的水提物及乙醇提取物为对照，对锦灯笼3种超临界萃取物中总黄酮和总酚的含量进行测定，并对其抗氧化和抗炎活性进行研究。在所有提取物中，SCEPP-5 的总黄酮 (234.63 plusmn; 9.61 mg/g) 和总酚(90.80 plusmn; 2.21 mg/g) 的含量最高。在浓度范围 0.1-30 mu; g/mL内， SCEPP-5 清除超氧阴离子能力和抑制黄嘌呤氧化酶作用最强。浓度为30 mu; g/mL时， SCEPP-5 能够显著抑制脂多糖 (LPS; 1 g/mL)诱导的小鼠Raw264.7巨噬细胞的细胞毒性。在浓度范围 10-50 mu; g/mL内，SCEPP-5可显著抑制LPS诱导的NO释放和PGE2形成，并呈剂量性依赖。浓度为30mu; g/mL时，SCEPP-5能够有效抑制LPS对诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶-2（COX-2）的表达。综上分析，与锦灯笼其他提取物相比SCEPP-5具有非常强的抗氧化和抗炎活性，其抗炎作用可能是通过抑制iNOS和COX-2的表达实现的。

关键词：超临界流体萃取;锦灯笼;抗氧化;抗炎;诱导型一氧化氮合酶;环氧合酶-2

  1. 引言

自由基是衰老、冠心病、炎症、中风、糖尿病、风湿病、肝病、肾功能衰竭和癌症等疾病发生的根本原因。炎症细胞中多形核白细胞易产生和释放活性氧（ROS）和活性氮（RNS），包括bull;O2-（超氧阴离子）、bull;OH（羟基自由基）、H2O2（氢过氧化物）、NO（一氧化氮）和1O2（单峰氧基根）等自由基。ROS的大量产生会损害核酸，蛋白质，碳水化合物和脂质等生物分子，造成细胞和组织损伤，从而使炎症加重。

脂多糖（LPS），它是革兰氏阴性细菌细胞壁的成分，是炎症和感染期间激活细胞的巨噬细胞，肝细胞和单核细胞的信号。小鼠巨噬细胞的内毒素导致诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）的表达，其催化L-精氨酸和氧分子生产大量的NO（希布斯等人，1987）。此外，前列腺素（PGE2）是花生四烯酸通过环氧合酶转化炎症的关键介质。环氧合酶-2（COX-2）是能提高炎症过程PGE2的产生量。超临界萃取（SFE）可以提供比传统的溶剂萃取的特殊优势，如增加了选择性，迅捷和环保。二氧化碳（CO2），其中有被化学惰性的优点，SFE是溶剂的标准选择用于天然产物，如食物，调味剂和制药工业。研究发现超临界萃取法提取物比通过常规手段获得的提取物有更显著的抗氧化活性。翡翠管的超临界CO2提取物也表现出抗炎活性。

锦灯笼（PP）被广泛用于民间药物用于治疗疾病，例如疟疾、哮喘、肝炎、皮炎、利尿和风湿。其提取物，也可用于制备保健饮料。我们以往的研究表明，PP的乙醇提取物具有较强抗氧化活性和抑制肝癌癌细胞增殖的效果。但其超临界萃取前的抗氧化和抗炎活性从来没有评估。在这项研究中，我们的目的是研究以更有效的提取方法准备PP提取物，同时不影响其抗氧化和抗炎症活动。

  1. 材料与方法

2.1化学物质

二甲基亚砜（DMSO），青霉素，链霉素，抗肌动蛋白，MTT，脂多糖（LPS）从Sigma化学公司购买。胎牛血清 (FBS) 和 DMEM 培养基取自 GIBCO BRL (盖瑟斯堡，医学博士，美国)。用于前列腺素 的测定的试剂盒从开曼化学有限公司购买。从Santa Cruz机构(美国，加利福尼亚州，圣克鲁兹分校)购买了抗COX-2 和抗 iNOS抗体。从麦格(麦迪逊，威斯康星州美国)购买了抗鼠IgG抗体。纯度gt; 99%(食品级)的二氧化碳由云山村气体有限公司 (台南县)提供。所有其他化学品和试剂均为分析纯。

2.2植物

锦灯笼从台南区农业改良场获得，台湾高雄医学大学研究生学院的林教授证实其为天然产物。PP 叶干，磨成木屑形式，然后一直气于密棕色瓶中，直到使用。

2.3热水提取

取锦灯笼粉末100克，每次加水1L，提取3次（1h/次），合并滤液，浓缩，冷冻干燥，称重， 4℃保存，备用。

2.4乙醇提取

取锦灯笼粉末100克，每次加乙醇1L，室温浸提3次，每次6d，合并滤液，浓缩，冷冻干燥，称重， 4℃保存，备用。

2.5超临界萃取锦灯笼提取物

根据杨等人描述的方法进行提取。取5克PP粉末溶解置于SFE盒，将部分PP萃取液与作为改性剂的4％或5％乙醇混合，剩下的不加乙醇，然后和液态CO2一起连续供给超临界流体系统。超临界CO2萃取5分钟后静态提取30min至1h。节流温度和提取压力分别设定在600℃和400巴。提取液收集在10mL乙醇中。除去溶剂后，将干燥的超临界CO2萃取PP提取物收集后称重并进行随后的化学和生物学分析。未用乙醇作为改性剂得到的试样为SCEPP-0，而分别用4％和5％的乙醇作为改性剂得到式样为SCEPP-4和SCEPP-5。

2.6总黄酮的分析

根据邹等的比色法测定PP提取物的总类黄酮含量。在0.5mL样品溶液中加入2mL蒸馏水和0.15mL 5％的NaNO2溶液。培养6分钟后，加人0.15mL10％AlCl 3溶液并静置6min，再往混合物中加入2mL 4％的NaOH，再立即将水加入到样品中至最终体积5mL，将混合物充分混合并静置15min。测定混合物在波长510nm处吸光度。芦丁被用作总黄酮含量测定的标准化合物。所有值均用每g提取物中含多少mg芦丁表示。

2.7 总酚分析

根据福林-酚法对PP的总酚含量进行分析。将2.5mL蒸馏水，0.5mL福林-酚试剂和1.0mL碳酸钠试剂（75g/L）加入PP提取物中，充分混合后在室温下保温30 min。用分光光度法测混合物在波长765nm吸光度。总酚含量以每克PP提取物含多少毫克没食子酸表示。

2.8 细胞色素C测试

采用超氧阴离子酶的形成测定细胞色素C方法的减少。10mg样品溶解在1mL蒸馏水或DMSO中，然后用50mM磷酸盐缓冲液（pH7.8）稀释成各种浓度（0.1-30mg/mL），加入0.07units/mL黄嘌呤氧化酶，100M黄嘌呤和50M细胞色素c。在室温下下培养3min后，用分光光度法测它们在波长550nm处的吸光值。

2.9 黄嘌呤氧化酶抑制试验

通过从黄嘌呤形成尿酸的量来测定黄嘌呤氧化酶的活性。10mg样品溶解在1mL蒸馏水或DMSO，然后用50mM KH2PO4缓冲液（pH7.8）稀释成各种浓度（0.1-30mg/mL）。后加入100 M 黄嘌呤和20mu; g黄嘌呤氧化酶（0.4单位），将样品培养3min。在室温下，通过分光光度法测在295nm的吸光值来计算尿酸产生量。

2.10 细胞培养

小鼠Raw 264.7巨噬细胞系获自美国典型培养物保藏中心（ATCC号TIB71中心，Rockville，MD）。细胞培养在含10％FBS，100units/mL青霉素和100mu;g/ mL链霉素的90％DMEM中，于37℃，5％CO2的潮湿环境中保存。

2.11 MTT法测定细胞存活率

在96孔板进行细胞毒性研究。Raw264.7细胞培养在含10mu;l DMEM 培养基的每孔 5times;105 细胞的96孔板中，经一夜的培养化后添加SCEPP-5或EEPP，继续培养24h。将细胞洗涤一次后加入50mu;l含有MTT（5mg/mL）的FBS培养基中，37℃温育4h后弃去培养基，在细胞中形成溶于DMSO的蓝色络合物。测量其在550 nm的吸光值。

2.12 亚硝酸盐测定

将细胞在LPS（1mg/mL）或加不同浓度（10mu;g/mL，30mu;g/mL和50mu;g/mL）SCEPP-5的LPS培养24h后除去培养基中的上清液。根据Griess反应，将培养基中积累的亚硝酸盐含量作为测定NO产生的指标（海斯等，2001）。将100mu;l每种上清液与等体积Griess试剂(含1％磺胺，在5％磷酸和0.1％萘基乙二胺的水溶液)混合，然后在室温下培养10min，用酶标仪测定550nm处吸光值。以亚硝酸钠标准曲线计算样品中NO产量。

2.13 PGE2 测定

根据制造商的说明，使用ELISA试剂盒在培养基的上清液进行定量的前列腺素E2（PGE2）测定。

2.14 免疫印迹分析

将细胞在 LPS（1mu;g/mL）或加 SCEPP-5（10和30g/mL）的LPS 中培养24h，并从中提取细胞蛋白。在含1 mM苯甲基磺酰氟，10g/mL亮肽素和1g/mL抑肽酶的萃取缓冲液（10 mM Tris–HCl， pH7.5，0.1% NP-40, 0.5%脱氧胆酸钠 , 0.1% SDS, 1 mM原钒酸钠和 120 mM NaCl)）中制备胞浆蛋白提取物。提取物在10,000 times; g下离心10min。等量的蛋白提取物 (50 g/lane) 用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳并通过电泳转移到聚偏氟乙烯膜上。在室温下，用含PBS (PBST)的5% (w/v)脱脂乳抑制非特异性结合位点1h后，膜在含PBST的5% (w/v)脱脂乳中与特异原发性抗体（即INOS(1:500)抗体, 抗COX-2 (1:500)抗体和抗肌动蛋白(1:5000)抗体）于室温下培养1h。通过各自的二次抗体来检测抗体的识别，即抗小鼠IgG抗体与辣根过氧化物酶相连。抗体结合蛋白用ECL Western印迹分析系统检测。用肌动蛋白的表达作为对照。

2.15 统计分析

数据用来自三个独立实验的原值plusmn;标准差（SD）来表示。采用单因素方差分析，然后使用统计分析系统进行邓肯的多个范围的测试。对照组和实验组各自使用Student t检验进行比较，当P值lt;0.05表示存在显著差异。

3 实验结果

3.1不同萃取方法获得的锦灯笼提取物量

通过热水（HWEPP）和乙醇（EEPP）中得到的PP提取物的产率分别为20.7％和24.0％（表1）。不同条件下的超临界萃取，其产量的多少存在很大差异。提取物的产量随着改性剂百分比的提高而提高，从 4%乙醇(SCEPP-4)的6.88%到5%的乙醇(SCEPP-5)的15.47%。所有提取物的显色会随着提取条件的变化而变化，很可能使总提取物的质量受到影响。

3.2锦灯笼提取物的总黄酮和总酚含量

结果表明，EEPP的总黄酮、总酚含量比HWEPP和SCEPP-0高，但比SCEPP-4和SCEPP-5低。随着超临界CO2萃取中改性剂乙醇百分比的提高，提取物中总黄酮和总酚含量不断增加。在不同的提取物中，SCEPP-5的总黄酮（234.63plusmn;9.61mg/g）和总酚（90.80plusmn;2.21mg/g）含量为最高浓度（表2）。

3.3.自由基清除活性

不同PP提取物对自由基清除活性的结果如表 3 所示。结果发现不同性质的PP提取物的清除作用均随PP提取物浓度增加而增加。在浓度 0.10-30.0 g/mL时，PP提取物的清除率范围从 12.19 plusmn; 1.87%到 69.48 plusmn; 3.34%。1.0 g/mL ，10 g/mL和30 g/mL 的 SCEPP-5清除率分别为47.75 %，60.51%和 69.48 %，比同浓度的alpha;-生育酚有更活跃的清除作用。其低的IC50值 (6.78 g/mL)，SCEPP-5可以有效清除超氧阴离子 (表 4)。另，极性更强的提取物HWEPP清除超氧化物自由基的活性较弱。

3.4.黄嘌呤氧化酶抑制试验

结果表明，所有提取物对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用呈浓度依赖性 (表 5)。在浓度 0.1-30 g/mL，所有提取物显示抑制率在0.80%至 67.22%不等。黄嘌呤氧化酶抑制作用的大小顺序是alpha;-生育酚 gt; SCEPP-5 gt; EEPP gt; HWEPP。除了HWEPP外，SCEPP-5和EEPP显示一个相对封闭的IC50值(6.76 g/mL)。然而，SCEPP-5 (7.48 g/mL) 的IC50值比EEPP (7.90 g/mL)稍低。

3.5. SCEPP-5和EEPP对Rw2.647细胞活力的影响

用MTT法检测来确定 SCEPP-5和 EEPP对细胞活力的影响。将细胞分别在含不同浓度(10，30 和 50 g/mL) LPS (1 g/mL)或没有LPS 的SCEPP-5和EEPP培养24h后，测定细胞数目。结果表明，LPS刺激的细胞中，30mu;g/mL SCEPP-5中细胞存活率明显优于50mu;g/mL EEPP，其细胞存活率为98%（图1）。因此，SCEPP-5被选为进一步抗炎症的研究的物质。

3.6.SCEPP-5对NO产生的影响

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