台湾猪舍污水处理系统中一株具有异养硝化能力的假单胞菌的分离外文翻译资料

 2023-01-10 16:15:32

台湾猪舍污水处理系统中一株具有异养硝化能力的假单胞菌的分离

原文作者:Jung-Jeng Su,1 Kuang-Sheng Yeh,2 Pin-Wei Tseng1

摘要：在台湾，猪舍污水中高浓度的NH4 是一个主要问题。因此，在我们的研究中，我们分离了土著异养硝化细菌来处理猪舍污水。异养硝化菌AS-1是从猪舍活性污泥系统中分离出来，并具有相关特点。在30℃培养箱中我们设置了三联密封的血清瓶来测定AS-1的异养硝化能力。所有的血清瓶含有80mL的培养基，瓶子顶部的剩余空间充满纯氧。实验结果显示，58h后 NH4 的浓度减少了2.5plusmn;0.2 mmolL-1，最终产生了1.5plusmn;0.5 mmolL-1的N2和0.2plusmn;0.0 mmolL-1的N2O。该菌的氨氮去除速率为1.75 mmolL-1 NH4 g cell-1 h-1。通过16S rDNA测序并与其他微生物比较，该菌鉴定为产碱假单胞杆菌属（97%相符）。因此，AS-1展现了未来对猪舍污水进行原位氨氮去除的巨大应用前景。

关键词：猪舍污水；异养硝化； 亚硝酸盐；氨氧化

猪饲养业在台湾农业中扮演着重要的角色。然而，我们必须控制和降低养猪场污水中的氮磷元素，避免水体表面富营养化[7]。未经处理的猪舍污水在固液分离后，氨氮和凯式氮的平均浓度分别为229plusmn;33.5和2736plusmn;3.9mgL-1 [17]。台湾的污水处理设施已经实现了猪舍污水约40%的氮去除率[17]。因此，我们需要在猪舍污水处理设施中引入异养微生物来提高氮的去除效率。

同时通过全面估算污水处理系统中自养反硝化、异养硝化和磷的去除来对生物营养的去除进行全面的研究[11]。同步硝化反硝化在一定程度上同时依赖于异养菌的好氧氨氧化和厌氧反硝化，异养菌能将beta;-聚羟丁酸作为电子供体[22]。自养亚硝化单胞菌表现出好氧脱氮的能力（NH4 →NO2-→N2O→N2）[2,15]，而报道称，异养菌兼具异养硝化和好氧脱氨的能力（NH4 →NO2-→N2O→N2）[13,25]。异养硝化只适合于含有高浓度环辛二烯氮的有机废水。大多数异养硝化菌能有氧脱氮，包括节细菌属[3,26]，泛养硫球菌（以脱氮副球菌为典型）[8,13,16]，P.反硝化菌[14]，粪产碱杆菌[12,25]。

蛋白胨和硫酸铵被用于降低氮源，从而研究特定微生物的异养硝化作用[3]。Doxtader和Alexander[6] 发现了beta;-丙氨酸在黄曲霉异养硝化途径中可能起到的作用。因此，在分离异养硝化菌时，beta;-丙氨酸常被用于充当唯一的碳源和氮源[3]。此外，含有0.05%酵母提取物的丙酮肟（7mM）也常被用来检测这6种假单胞菌株的硝化能力[4]。本研究将醋酸铵作为分离异养硝化菌实验的唯一碳源和氮源，并检验这些菌的氨氧化和降低亚硝酸盐的能力，以期未来能应用于台湾猪舍污水处理系统。

材料和方法

分离 培养基A（表1）用于分离异养硝化菌[18,19,20]。培养基中的唯一碳源是0.1%（w/v）醋酸铵[3]。本实验从未处理的猪舍废水、土壤及猪舍废水处理系统设备中的厌氧活性污泥中获得分离接种物。取稀释后的0.1ml 1%(w/v或v/v)的猪舍污水、土壤浸出液、污泥样品分别接种到含有150ml经高压灭菌后的培养基(A)的锥形瓶中。在30℃恒温培养48小时后，检测锥形瓶中的一些培养悬浮液中的亚硝酸盐百分数[5]。一旦发现亚硝酸盐含量降低，就将对应的剩余0.1ml的悬浮培养液接种到胰酪胨大豆琼脂平皿（培养基）中来获得分离的单个克隆。

有氧氨氧化和亚硝酸盐降低率的定性评估 有氧氨氧化：培养基(A)琼脂培养皿被用来检测它们的异养氨氧化能力。分离菌接种到含18.6mmol L-1 NH4 的在30℃有氧条件下的琼脂培养皿中。接种48小时后，培养皿中产生的亚硝酸盐用磺胺和N-(1-萘基)乙二胺试剂检测，观察颜色变化[5]。在不同情况下，未接种的培养基被用作无菌控制。 亚硝酸盐的降低：培养基(C)琼脂培养基包含KNO3（表1）用于分离菌的接种，并在30℃有氧和厌氧条件下接种，以此来检测它们降低亚硝酸盐的能力。在接种72小时后观察分离培养基的颜色变化来检测亚硝酸盐的产生[5]。

分离菌的鉴定 通过测它们的16S rDNA序列来鉴定分离出来的菌株。用通用引物16f27(5rsquo;-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3rsquo;)和16r1488(5rsquo;-CGTTACCTTGTTAGGACTTCACC-3rsquo;)[1]进行PCR扩增它们的16S rDNA。最后，PCR产物用根据片段大小(1.5kb)所制的琼脂糖胶检测。PCR产物通过割胶回收和用凝胶回收试剂盒纯化。普鲁泰克技术测序16S rDNA产物。最后，将分离菌的16S rDNA序列通过BLAST与其他微生物对比（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi）。

生物量测量 分离菌AS-1在培养基(A)富集培养至光密度(OD)600=0.55，将AS-1的细胞悬浮液通过与无菌磷酸盐缓冲液(pH7.5)混合制成连续浓度梯度的混合液，定容至20ml。接下来立即在波长为600nm的情况下测量细胞悬浮液的每个稀释浓度的光密度。用科赫的方法求的AS-1菌株的干重[10]。根据相关OD600值对应的AS-1的细胞干重量算出OD600与细胞量干重的线性回归关系。

亚硝酸盐降低量的定性评估 通过从生长在培养基(A)中的细胞悬浮液取样并划线分离得到纯化的微生物。接着测定分离纯化菌的亚硝酸盐富集情况。然后，取4.5ml的细胞悬浮液接种到含有150ml的培养基(B)的250ml锥形瓶中，一式三份，并在30℃有氧条件下进行。未接种的锥形瓶作为无菌对照。样品在15小时和27小时后分别用上述的亚硝酸盐显色试剂来测定亚硝酸盐的减少量[5]。

异养硝化和有氧反硝化的评估 按照表1准备一式三份的包含80ml培养基的118ml卷曲密封的血清瓶。将这些瓶子排空空气，在顶部空间加入69kPa的纯氧（经气相色谱分析大约90%纯氧），并在高压灭菌前用热导检测器测量三次。高压灭菌后，在室温下向瓶子里加入VS-盐，PS-1和V8溶液。在30℃条件下将取每个分离菌2.4ml培养液（OD600=0.18）接种到一式三份的瓶子中。定期取样测定其OD600值，NH4 ，NO2-。N2O和N2的生成。

分析 OD600指在波长600nm的分光光度值。此外，细菌悬浮液在3600g离心20min，测量上层液体的氨和亚硝酸盐水平。在425nm波长下进行氨测定敏感度为400ugNL-1的萘氏试验测定氨富集情况[5]。在波长543nm下通过显色实验测定亚硝酸盐量[5]。用空气阀注射器取瓶子顶部气体20ul，用GC-TCD分析氧气和氮气的含量[19]。同样用空气阀注射器取瓶子顶部气体500ul，用GC电子探测器测定N2O的含量[21]。O2,N2和N2O的量均用Su et al.的方法进行[19,21]。

结果和讨论

微生物 亚硝酸盐只在从接种在培养基A中稀释的活性污泥样品的悬浮液中发现。在这个培养悬浮液中，通过划线分离只得到2株纯种菌株，AS-1和AS-2。

有氧氨氧化和硝酸盐降低的定性评估 定性评估的目的是为了检测分离菌的有氧氨氧化和降低硝酸盐的能力。结果显示AS-1在含有NH4Cl的培养基中比AS-2生长快。在接种AS-1的培养基中几乎检测不到亚硝酸盐，而接种AS-2的培养基中有亚硝酸盐存在。结果表明AS-1能够进行氨氧化。在有氧条件下，AS-1在含有硝酸盐的培养基中依然比AS-2生长快，而且在48小时后在接种AS-1培养基中检测到更多的亚硝酸盐。结果显示，AS-1在有氧条件下可能将硝酸盐作为电子受体。没有菌株能够在有氧条件下包含NH4Cl的培养基上生长，除非缺少另外的有机碳如醋酸盐。因此，这两种菌株都是异养细菌。

有氧条件下AS-1和AS-2的氨氧化 将细菌悬浮液(7.5ml;AS-1 OD600=0.09或AS-2 OD600=0.05)接种到含有250ml无菌培养基D的500ml锥形瓶中，在30℃有氧条件下操作并一式三份。定期检测样品中NH4 ，NO2-的量和OD600值。实验结果显示，AS-1和AS-2的OD600值分别在57小时和45小时后达到稳定值。AS-1经33小时（Fig.1a）完全氧化2.7plusmn;0.1mmol L-1NH4 ，有氧条件下NH4 的去除率达0.064mmol L-1NH4 -Nh-1。然而，AS-2在153小时后（Fig.1b）氧化2.6plusmn;0.1mmol L-1NH4 ，有氧条件下NH4 的去除率大约为0.013mmol L-1NH4 -Nh-1。AS-1一贯地保持比AS-2优越的氨氧化能力。在培养45h后的AS-1培养液中检测不到亚硝酸盐的存在。因此，AS-1被选作高效异养硝化菌。

菌株AS-1和AS-2的亚硝酸盐降低量 将细菌悬浮液(4.5ml;AS-1 OD600=0.42或AS-2 OD600=0.25)分别接种到含有150ml培养基B的250ml锥形瓶中，在30℃有氧条件下操作并一式三份。在42h后AS-1和AS-2的OD600值分别为0.10plusmn;0.01（初始值为0.02plusmn;0.00）和0.07plusmn;0.01（初始值为0.01plusmn;0.00）。AS-1和AS-2培养液的亚硝酸盐含量初始值分别为0.33plusmn;0.02和0.35plusmn;0.01mmol L-1。27h后，所有的AS-1培养液样品中亚硝酸盐有效降低（NO2-=0.08plusmn;0.04mmol L-1），并且在42h后完全消除。然而，亚硝酸盐含量的降低速度在AS-2的培养液中则慢很多。

AS-1的鉴定 AS-1（术语为SU3）是革兰氏阴性，棒状菌，将它的16S rDNA与产碱杆菌LB9用BLASTn比较，最终鉴定为产碱杆菌（97%相符）。

AS-1的异养硝化和有氧反硝化 实验结果指出，58h后2.5plusmn;0.2mmol L-1NH4 被完全去除，消耗了顶部24.3%的氧气（fig.3）。AS-1的去除率为0.034mmol L-1NH4 h-1。此外，58h时OD600值为0.40plusmn;0.

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