产蛋白酶 CP1的中度嗜盐交替假单孢菌株CP76的筛选和鉴定外文翻译资料

 2023-01-10 16:15:40

产蛋白酶 CP1的中度嗜盐交替假单孢菌株CP76的筛选和鉴定

Cristina Sanchez Porro·Encarnaclon Mwllado˙Costanzo Bortoldo˙Garo Antranikian˙Antonio Ventosa

Springer-verlag 2003

摘要：总共分离和鉴定了26株蛋白中度嗜盐菌。大多数菌株为salinivibrio属的成员（16株），有的则被鉴定为枯草芽孢杆菌（4株）、Salinicoccus（2株），或该c-proteobacteria成员（4株）。其中CP76菌株是筛选出来作为胞外蛋白酶最好的生产菌，特别选中CP1用来做进一步的研究。16S rRNA基因在除了可以进行表型实验外，还可细菌中的Pseudoalteromonas基因进行定位。在生长指数的最后阶段检测到了蛋白酶的最大生产量。通过对CP1这种蛋白酶的提纯和生理生化检测，显示它的最适活动温度为55℃，PH为8.5，对NaCL浓度（0--4Mol）有很宽范围的耐受度。这种酶最有趣的特征是它温和的热活力，它活动在PH范围为6--10的环境中，而且，特别的是，它的盐耐受度（最适盐度为7.5%）。提纯后的蛋白酶的分子量为38kDa和和N-末端氨基酸序列决定了它的表型和以前描述过的金属蛋白酶类似。EDTA、PMSF和Pefabloc对这种蛋白酶的活力有很强的抑制力。没有明确的检测表明E-46，笨丁抑制素或者高抑酶肽对这种蛋白酶有抑制作用。这些结果都表明交替假单孢菌CP76菌株产生的这种胞外金属蛋白酶有适度的热耐受力和很强的盐耐受度。

关键词：极端环境微生物； 嗜盐菌； 蛋白酶；交替假单孢菌

引言

细菌产生的蛋白酶是自然界很好的一组水解酶，它可以催化几乎所有的蛋白质水解。除了他们的生理重要性，他们还可以很好的运用于商业领域。此外，有些种的嗜温细菌中的蛋白酶已经被提纯和鉴定，而且相应的基因已经被克隆，但是嗜盐菌中的蛋白酶还没有被广泛的研究。极端嗜盐菌，是一种古生菌的分支，目前有些种已经被鉴定出来，但是中度嗜盐菌中的蛋白酶并没有被提纯出来，也没有进行更深一步的研究。因为中度嗜盐菌可以在盐浓度很广的范围里生长（最适NaCL浓度为3--15%），它们就成为了一种在生物技术领域很有潜力的菌种。筛选和分离这种产活性蛋白酶的嗜盐菌将会帮助鉴别这些酶和克隆细菌的编码基因。这使得在工业生产中运用这样嗜盐菌的酶成为可能，并更有利于创造最佳的高盐浓度环境。对于这种酶的研究兴趣不仅是它在生物技术新应用方面的潜力，更要了解嗜盐菌作为极端环境中的普通生存者，它的内在抗盐属性和胞外蛋白酶的作用机理。

为了分离出中度嗜盐菌中产生的蛋白酶，我们进行了筛选。总共有26株从盐田和盐性土壤中被分离出来的能够水解蛋白的中度嗜盐菌。CP76菌株是筛选出来产生胞外蛋白酶最好的菌株。目前，我们已经分离并鉴定出了这种蛋白酶CP1。对于盐和温度的高耐受度使得这种酶不仅在工业应用领域有很大价值，而且在阐明这些嗜盐微生物的高活性的酶的分子基础上也有很大作用。我们知道，这些研究的第一步就是对中度嗜盐菌产生的酶做提纯和鉴定。

材料和方法

菌株和培养条件

菌株在盐浓度为10%（wv）和补充酵母提取液0.5%(wv)的盐性培养基中进行常规培养。并根据需要，补充相应的盐分，CP76的生长曲线应该包括在培养是时Perkin-Elmer分光光度计监测生长期间的600nm吸收值。为了达到这个目的，用250ml的烧瓶，每一个都装有50ml的SW培养基，在稳定的相位中进行培养。培养过程应在37℃和250转速的摇床中进行。

通过测定菌株在添加不同碳水化合物的SW-7.5培养基中的生长量，例如：乳糖、蔗糖、甘油、麦芽糖、甘露醇、果糖、葡萄糖（50mM）、氯化铵（50mM）、或者氨基酸(Difco)(1%)，可以探究不同培养条件对于蛋白酶产量的影响。和之前的研究一样，检测菌株的生长，在培养24小时以后检测蛋白酶活力。

筛选具有蛋白水解活性的菌种

从位于Isla Cristina (Huelva, Spain)盐田的水、沉积物和高盐的土壤中分离出 了310株中度嗜盐菌株。并把样本收集在无菌塑料容器中，在六小时之内进行涂板。在培养过程中通过定量测定，筛选出蛋白水解活力强的菌株。培养基为牛奶50%，最高盐分10%（w/v）、酵母菌提取液和1%的蛋白胨。最后加入20g/l的琼脂使培养基凝固。48小时后在菌株出现水解圈就可以证明蛋白水解酶的活力。

菌株的特性

通过进行形态学研究，生理生化研究，营养特点调查来对菌株进行分类。具体的方法为革兰氏法，过氧化氢酶法、氧化酶法和其他传统的生化鉴定方法。通过运用生物自动鉴别系统来进行95种营养测验。菌株在单独的培养基中在37℃下培养24小时，菌落的密度范围运用分光光度计21101进行测量。盐溶液中在有细胞悬浮以后立即将细胞转移到无菌的储液囊中，利用GP和GN接种125mu;l的菌株悬浮液。接种后的平板在37℃下培养24小时，最后利用Microlog3.59程序对平板的结果进行自动检测。

DNA提取和16s rRNA序列分析

分离菌株CP76的DNA，其沉淀物利用CTAB原理对细菌的DNA进行预处理。

运用以前就详细研究过的技术进行16s rRNA基因的PCR扩增，前引物为16F27序列，后引物为16R1488序列。运用DNA自动扩增器对中心序列直接进行扩增。最后运用Arahal et al的方法利用电脑程序进行数据分析。

酶活性分析

水解蛋白活力可以通过改良的Kunitz方法检测。具体方法是：样本（一式两份），其中包含有400mu;l的5%的酪蛋白，还含有50mM Tris-HCl pH的缓冲液，在酶的最适PH和温度中培养30到60分钟。酶的反应将在加入500 mu;l of 10%(wt/vol）的三氯乙酰的酸溶液后停止，仍保持原有温度10分钟。样本的混合物在离心机中用13000rmp的转速进行处理，并且测量280nm出的对照吸光度。每一组蛋白酶的酶产出量和酪蛋白的产出量相同。根据Bradford蛋白浓度测定可至酶水解蛋白的活性。

凝胶电泳

天然的从Novex来的聚丙烯酰胺凝胶含有4-10%的浓度梯度。在120V，4℃下跑胶6小时。高分子标记蛋白可以用来作为对照。为了检测蛋白的亚基成分，蛋白质样本也需要进行SDS-PAGE处理，过程要在60℃进行10分钟。用小分子蛋白作为对照。经过以上过程，蛋白质将被用0.1%Commassie蓝染色。酶谱染色的蛋白水解活性的原位检测，根据heussen和Dowdle（1980）与0.1%（重量/体积）的明胶为基板。电泳后的凝胶用0.25%（体积/卷）的Triton X-100在4℃下 1小时内除去SDS，并且下的最优试验条件下培养10–30 分钟检测蛋白水解酶活性。

蛋白酶CP1的纯化

CP76菌种培养后，取出培养液，并将培养液在12000g，4℃下离心30分钟。无细胞的上清液在含有20mMTris-HCl,pH8.5(butterA)的悬浮液中进行透析。取上清液，然后装上Q-Sepharose柱（2.5·20厘米）平衡缓冲直到在280 nm处检测无吸收。反应柱要用缓冲液A和缓冲蛋白液清洗过。用线性0–0.5 M NaCl梯度在缓冲区的活动分数进行汇总。在20mMTris-HClpH8.5的条件下对0.1MNaCl缓冲液B进行超滤浓缩、透析。浓缩的样品提供了一个快速蛋白质液相色谱Superdex Pharmacia，将S-200预备柱（1.5·96厘米；）连接到一个缓冲液B中具有Pharmacia FPLC平衡系统上。并用相同的缓冲液进行冲洗，和1毫升的组分进行收集，速度为一个1毫升/分钟。使每个样品中都包含有用SDS-12%PAGE.处理过的酶。

PH、温度和盐浓度的影响

用上述相同的方法测定pH对于蛋白酶活性的影响，但是其中要用120mM普通缓冲液代替Tris-HCl缓冲液。使得PH值从3.5到10.，所有酶都在55℃下操作。关于温度对酶活性的影响，样品在25-75℃之间培养30分钟。恒温器可以使样本在不同温度下，在普通缓冲液中产生不同的影响。在不同温度培养后，取出样品，并测定澄清离心法和酶活性。测定盐的影响，则利用之前的常规方法。

金属离子和抑制剂对酶活性的影响

其他物质对于蛋白酶活性的影响可以用含有各种金属离子和其他离子的试剂，对已经提纯的酶在不同条件下的培养，来检测其酶的活性，环境为55℃培养60分钟。蛋白酶抑制剂有：抗蛋白酶，乌苯美司，凝乳，E-64、乙二胺四乙酸钠、肽酶、胃蛋白酶、苯甲基磺酰氟（PMSF）和抑肽酶，最后在不同终浓度中加入酶—马蒂奇混合物。这种混合物含有5%的酪蛋白，50毫米Tris-HCl缓冲液，pH 8.5的酶，分别在室温和55%的条件下培养1小时。残留的蛋白酶活性测定如前所述。对于测定金属离子的影响，方法同上，但反应的混合物在加入相应的盐后应在室温下培养，之后进行测定。如前所述。无抑制剂或活动金属离子时的酶活性被视为100%。

氨基末端分析

氨基端的测序是运用带有PDVF膜的带电样品的与自动Edman降解测序仪脉冲液体模型473A，Applied Biosystems，福斯特城，加利福尼亚）连接对乙内酰苯硫脲衍生物的高效液相色谱装置在线鉴定，按照厂家规定的程序进行。

结果

菌株的筛选及其特性

为了测试从310种中嗜盐菌中分离出的蛋白水解酶的活性，将采用Materials描述的方法利用平板进行检测。在对菌株的试验中，有26株在牛奶琼脂平板中显示出水解蛋白的活性，所有的这些蛋白酶菌株都通过生物自动识别系统进行鉴定。因为Biolog板营养试验革兰阴性和革兰阳性菌反应不同，所有先对细胞进行革兰氏染色试验。其中6株为阳性，20株为阴性。根据他们的表型特征，包括氧化能力，95种不同的化合物，分离出来后已经被鉴定分为以下几个钟：16株salinivibrio属，4株芽孢杆菌，2株Salinicoccus、和4株的c-Proteobacteria成员，其中3株菌Halomonas sp.。

产生的蛋白水解酶的测定

已经确定的研究表明，在没有很好的相关性的区域间，检测菌落对牛奶琼脂平板产生的蛋白酶的活性。为了能够更为定量的评价蛋白质的产量，可以在每株菌株的上清液中加入酪蛋白进行培养。蛋白酶产量鉴定的结果显示CP52、CP56、CP57是活性最高的菌株。由于对菌株的上清液进行了部分的生理生化检测，使我们最终选择了CP57最后后续研究的最理想菌株。CP76菌株的上清液显示出很强的蛋白酶活力和很高的盐耐受度。酶上清液在1MNaCl,pH8.5,and55C时有很强的活性。

菌株CP76的特征

这种细菌最适的盐度为10%左右。根据Kushner的定义，CP76是一种中度嗜盐菌。为了定为它的系统发育位置，16s rRNA测序是一种很好的方法。把CP76的基因序列和数据库中的序列进行比较，发现CP76属于Pseudoalteromonas（90-95%相似）。这个结果，加上其他的生理生化实验，我们把CP76定为Pseudoalteromonas属，为Pseudoalteromonas sp. CP76菌株。

最佳蛋白酶活性生长条件的测定

为了确定胞外蛋白酶活性的最佳生长环境条件，可以分析几个因素产生的影响。样本是在不同时间采集的，而且酪蛋白水解酶的活性在无菌的培养基中已经测定过，在整个生长过程中蛋白水解酶的活性没有被检测到，但是在稳固生长阶段，检测到很高的值。

最高的蛋白酶活性在培养基氯化钠浓度为7.5%的时候，稍低的活动是在3%或10%时，但是，s当使用w-15（15% NaCl）时，活性下降了约2倍。此外，还对不同培养温度对酶的影响生产进行了评估。最优增长温度为37℃，在这个温度测定得最高的蛋白水解活性。

为了测定不同营养素的影响，把CP76分别培养在存在和缺乏营养素的培养基当中，分别记录生长情况和蛋白酶的活性。在酶产量最高是求出用蔗糖，果糖和甘油的量，意外的是：麦芽糖会被蛋白酶抑制。而对于蔗糖和乳糖的含量没有特别的影响。酪蛋白氨基酸，NH 4 Cl，甘露醇，营养肉汤、蛋白胨，导致在良好的生长的同时而抑制蛋白酶活性。这个结合酪蛋白氨基酸和使NH 4 Cl下降的是蛋白酶的生产而不是细菌的生长。（表一）

蛋白酶的分离纯化及其性质

蛋白酶产生菌菌株Pseudoalteromoas76从sw-7.5培养上清中纯化的材料与方法说明。蛋白酶的纯化的过程是总结在表2。在阴离子交换层析和凝胶过滤后，是与一个特定的蛋白酶的纯化65倍活性为133单位/毫克的蛋白，最终产量为2.9%。纯化的酶活性的差异基于同的基材，包括酪蛋白（数据未显示）。对分子质量的SDS-PAGE分析

纯化的酶显示38 kDa为单一条带（图1A）。另一种酶，在图1b所示，显示高活性蛋白酶的纯化。一个酶谱在天然条件下进行也表现出了一系列相同的分子量，表明该蛋白是一个单体的为38 kDa。动力学研究显示，在酪蛋白的存在下蛋白酶CP1为底物允许米凯利斯Menten PA测定在pH值为8.5和55℃时，大约有7.1mu;M测量

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