培养基，接种量，培养时间对于土壤细菌可培养与分离的影响外文翻译资料

 2023-01-10 16:15:56

培养基，接种量，培养时间对于土壤细菌可培养与分离的影响

Kathryn E. R. Davis, Shayne J. Joseph, and Peter H. Janssen*

Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia

摘要：土壤中生存着许多系统发育而来的细菌种属，这些细菌在可培养研究中因极少被分离培养而没有很好被人们研究。培养这些细菌失败的一部分原因是当这些土壤细菌被接种到标准微生物培养基上后，很难形成可见的菌落，从而导致了可计数的活菌数少。我们通过评定CFU在固体培养基上的数量和鉴定分离出的细菌种类，研究了三种因素对活菌数的影响。这些因素是接种量，培养基种类和培养时间。减少接种量可明显导致活菌数增加，但并未提高那些罕见的菌体的细菌菌落的形成。传统培养基只能得到较低的活菌数，并且不能分离得到那些罕见的菌体的细菌。相反，新开发的培养基可得到较高的活菌计数和许多种罕见的菌体的细菌，且无论接种量大小。结合适当的方法，延长培养时间到3个月使得罕见的菌体细菌的菌落的得以生长。一旦分离，罕见的菌体细菌的纯培养时间也要比常见细菌的纯培养时间更长。使用这些新的方法和延长培养时间，我们能够离出酸杆菌门的许多成员（细分为1，2，3，4），芽单胞菌门，绿弯菌门，和浮霉菌门（包括先前未得到培养的WPS-1世代

以及放线菌门中红色杆菌亚纲和酸微亚纲的成员。

正 文

土壤中包含着许多系统发育而来的细菌种属，它们在全球都有分布而且个别种的对土壤细菌群落的作用突出（3，10，23）。然而，直到最近，这些群体中的许多菌都没有代表菌株可用于详细研究，因为它们在实验室培养基中没有明显的生长。只有少数在（通常只有约1%）每克土壤的细菌细胞大于109的细菌，才能够在实验室培养基下形成菌落（5，14，28）。由于微生物学家培养在实验室中培养代表菌株的不足，导致了许多土壤细菌群体不能很容易地研究。但是最近，通过新培养基和延长培养时间增加菌落数和从少量接种的培养基中形成的小菌落中分离挑选，一些以往罕见的细菌得以培养（12，15，24）。这些方法是以以往的研究经验选择的。获得的菌株中，有许多是属于酸杆菌门，一些是属于疣微菌门和芽单胞菌门以及放线菌门的子集酸微菌亚纲和红色杆菌亚纲（12，15，24）。由于土壤中代表菌株的培养的缺乏，这些菌研究十分的不足。

本研究的目的是调查生长培养基，接种量，菌落密度，和培养时间对土壤中研究不足的细菌（后称罕见细菌）在添加了土壤浸出液的固体培养基上菌落外观上的影响。

材料与方法

细菌菌株。铜绿假单胞菌185（ATCC 10145）、荧光假单胞菌192（ATCC 13525）、巨大芽孢杆菌4R6259（ATCC 9885）、枯草芽孢杆菌（ATCC 11774），少动鞘氨醇单胞菌CL1 / 70（ATCC 29837），野油菜黄单胞菌GB296，青紫色素杆菌MK（atcc12472），和Kocuria rhizophila PCI 1001（ATCC 9341）采集自墨尔本大学微生物学和免疫学系。这些培养物被保藏在营养琼脂（见下面），并用于测试培养基的质量。他们的种属鉴定经过16S rRNA基因的比较，经过电泳和排序（见下文），通过BLAST网站将序列在GenBank序列（www.ncbi。NLM.NIH.gov）进行比对（1）

我们从实验室收集五十个分离菌株用于实验，以确定不同种属的菌株在不同的培养基上生长能力。这些菌株是来自于相同的采样点的土壤，或分离于早期的研究（12，15，24；C. A.奥斯本和P. H.詹森，未发表的数据；P. Sangwan和P. H.詹森，未发表的数据）或在本次研究分离。这些菌株来自于九种不同的细菌门，最多，两名来自同一个科（表1）。

土壤采样。土芯（100毫米长，25毫米直径）采集自the Dairy Research Institute,Ellinbank, Victoria, Australia（38°14.55 S，145°56.11 E），通过围场的土壤取样器收集。土壤特性和围场管理方案已在别处详述（25,27）。完整的土样放在铝盘上的聚乙烯袋中运送到常温实验室，后进行3小时处理。收集的日期分别为2001年3月2日，2001年四月5日，2003年5月29日。除非另有说明，实验从最后一次取样时间开始。去除超过30毫米的泥块，根块和大的石块也从剩余部分去除，然后经2mm孔径铜筛的高压灭菌（Endecotts公司，伦敦，英国），混合，并立即用于微观调查，干重测定，或栽培试验。经4rsquo;,6rsquo;-diamidino-2-phenylindole加吖啶橙染色（S. N.凯恩达夫和P. H.詹森，未发表的数据），用显微镜统计混合土壤样品的细胞数。刚过筛的土壤样本准确称量并在105°C下干燥3天。当样品在干燥器冷却至室温后对样品进行重新称重，对土壤干重进行换算，所有结果均表示为每克干土。

培养基。根据约瑟夫等人描述制备添加结冷胶和不同的生长基质的VL55培养基（15）。

这些生长基质及其在配方浓度如下：2mm的N-乙酰葡糖胺；混合的D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-阿拉伯糖（0.5毫米[每个]）（15）；混合的D-半乳糖醛酸，d-glucuronate，L-抗坏血酸，和D-葡萄糖（0.5毫米[每个]）（15）；混合苯甲酸，乙酸，乳酸，和甲醇（0.5毫米[每个]）（15）；氨基酸组合（9）与0.08克每100毫升原液L-色氨酸增加，10毫升加原液每升培养基；0.05%（重量/体积）海藻酸钠；0.05%（重量/体积）黄原胶；0.05%（重量/体积）果胶；0.05%（重量/体积）木聚糖（VXylG）；和0.05%（重量/体积）羧甲基纤维素。在Sait 等人的理论指导下（24），VL55培养基以琼脂作为固化剂，与0.05%（重量/体积）木聚糖（中VXylA）或10毫米葡萄糖（VGluA）制备成了生长衬底。加入1M被过滤灭菌（0.22 m-pore-sizefiLTER）的葡萄糖溶液。根据詹森等人所描述的，将稀释的营养液，用琼脂（DMBA）或结冷胶（DNBG）凝固。（12）。提取土壤浸出液琼脂（CSEA），维诺格拉德斯基盐琼脂（WSA），10倍稀释的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA 0.1）制备，以上配方依据byjoseph等人描述。（15）。准备8克营养肉汤琼脂培养基（BD诊断系统，火花，马里兰州）和15克细菌琼脂（Oxoid）1号每升蒸馏水，调节最终pH值约为6。

所有的组都用90毫米直径的聚苯乙烯培养皿。

培养试验。准确称量样品新鲜筛土（约1克），声波降解后分散在的100毫升无菌蒸馏水（12）。将这些稀释到10-3，10-4，10-5，10-6，10-7（12），取最后三个稀释度每个200微升，接种3个或5平行培养基，在每个稀释级构成计数组，9或15板。用无菌玻璃棒，接种在琼脂表面或凝胶表面。安装三个或七个计数器在每个培养基中的每个土壤样品。所有1170个培养皿在25°C在黑暗中培养16周，周遭用聚乙烯袋（40微米厚度）密封。

活菌计数表示为相对于土壤的干重。预计接种量（表示为细胞每板数）：显微镜下测定土壤中总计数细胞后稀释，利用稀释菌剂和涂板卷分散到培养皿上。可培养性体现为特定培养的样本占总计数活细胞数比率。

培养平板3天后，以7天一周期，采用2倍放大镜观察菌落。当可见菌落形成时，本周的中点被认为是菌落形成的时间（1.5天，如果菌落出现在3天内）。然而，如果刚刚看到菌落的时候，恰是周期开始或结束，则采用该时间计算。

t 测验（双尾），方差分析（ANOVA），以及X2测验结果都采用Excel 2001软件记录（Microsoft Corp., Redmond, Wash.）。

分离鉴定。菌落是随机选择和培养于VGluA，0.1times;TSA，WSA，CSEA，或DMBA。16SrRNA基因序列（400个核苷酸[nt]）由约瑟夫等人研究指导下确定（15）。菌株鉴定通过获取部分16SrRNA基因序列（401到1452nt），然后利用BLAST比较这些序列在GenBank数据库（24）。识别标准是根据约瑟夫等人所描述的（15）。系统发育和分类分组的命名一般遵循加里蒂等人的研究。（8），除酸杆菌和芽单胞菌门类，其他都遵循Hugenholtz等人的方案。（10）和张等。（29）浮霉菌门的分类（细分），是基于富尔斯特等人的方案（7）。该门的分支--The WPS-1，是由诺加利斯等人命名。（20）。分类遵循的计划，使用约瑟等人的研究（15）。

核苷酸序列号。研究所得的所有的部分16S rRNA基因序列已存放在GenBank数据库中登录号为ay673424下ay673167。

结 果

每个平板的最小菌落数。我们进行计数的CFU细菌能够在12周内接种形成可见的菌落。土壤样品被水稀释，稀释成不同的稀释度溶液，每个稀释度都接种在各种不同的平板上和每个都做三个（2001个土样）或5个（2003土样）复制板。正如预期的那样，菌落数计数板的变化量随着设置的复制板增加，菌落在3或5块平均数下降（图1A）。每个计数格上每板菌落数平均为大于40，稀释水平平均为19.7%的情况下，（3或5板有n = 57个计数格），系数变异系数（标准差除以平均值）是相对恒定的。稀释水平与平均菌落数小于每板40有较大的系数变异系数（平均= 52%；最大= 173%；n = 160），在不同的技术格中也有所不同。

图.1-A、B、C

接种量的影响。当使用10倍更小的接种物时，在孵育12周后未发生预期的10倍减少菌落数。相反，按接种量，每减少10倍只有约5倍菌落数减少（5.2 2001试验2003试验5.7倍菌落数）。因此同样接种了10倍的接种量，在10倍的接种量上菌落数要2倍高于正常接种量(图 1B)。只有在非常低的菌落计数这种效果不明显（图1C）。于是根据统计，活菌数在所有培养基中都较大时，应采用较稀的接种量来计算活菌数（P小于3times;104不同菌剂在配对t检验和n = 60计数都分别考虑三种稀释水平，每个稀释度的三个重复数据采用2001年的数据；P小于4times;104和n = 42计数三个稀释水平，每稀释级的数据复制2003年）。

图.2-A、B、C

图2A显示增加的活菌数（P小于5times;106连续稀释水平比较）伴随着增加的三种培养基接种量，会导致数目剧增。直接免疫荧光显微镜计数细胞（过筛，混合土的15个样品每个取至少30处，）显示，用于实验的土壤样品中，每克干土有1.28times;10 9细胞（标准差[SD] = 5.03times;108）。这使我们能够计算出平均每个稀释级的预期的接种量。这意味着可培养性，表示为在CFU在接种物细胞中的百分比数，将随着接种量的下降而增加（表2）。然而，群体动力学的发展对于不同的接种量无显著差异（图2B）。

基于这些结果，我们决定计算接种了稀释度最高（最少每板10个菌）的盘中的活菌数，三或5个平行平板中稀释级。为了减少这些菌落数的变异性增加，我们准备了每种类型培养基的多个计数集。

生长基质的选择。在25℃下培养12周，在以结冷胶为固化剂，且含有不同生长底物10个的VL55

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