内生菌对试管培养的拟南芥生长影响的研究外文翻译资料

 2023-01-10 16:16:59

内生菌对试管培养的拟南芥生长影响的研究

原文作者 Francesco Dovana1*, Marco Mucciarelli2*, Maurizio Mascarello2,

Anna Fusconi2*

摘要：内生菌有影响植物生长的作用且能提高宿主植物的抗逆性，然而，从水生植物中分离出的内生菌（对水生植物生长）的影响并不大。在本研究中，分别对茎处分离而得的真菌 (茎菌)和薄荷属水生植物（水生薄荷）的根（根菌）进行了标记，接种后的14到21天用于拟南芥试管培养以分析其形态发展属性。利用ITS对19株菌株进行了分析，结果表明17株菌株分别呈现出显著的遗传学差异。水生薄荷菌对于拟南芥的湿重和干重的整体影响分别是中性和阳性的，大致在接种后的14天拟南芥干重增加，这可能与植物的防御机理有关。在接种后的14到21天，只有3株菌株既增加了湿重又增加了干重，这些就是植物益生菌。从接种后的14天起，经过内生菌处理的多数拟南芥菌株的根系深度和初生根长度减小，其根面积和侧根的生长也受到了抑制。在接种后的21天，只有水生薄荷益生菌中的茎点霉菌，既使得菌株扩大了根面积又增加了根长。接种后的14天根长和根面积会影响菌株的干重，表明根系会扩大，进而能够吸收养分，这是植物增加干重的重要决定因素。拟南芥根长的缩短很大程度上是因为植物经过了茎菌处理，因为植物经过茎菌或根菌处理其根面积分别会扩大或缩小，这表明了内生菌影响着根尖的生长。世界各地已开始种植水生薄荷以及别的水生植物用于水污染治理。从未来实际应用的角度上，本文提供了一个能够筛选出调节植物生长的内生菌的模型。

关键词：内生菌；水生植物；拟南芥；生长调节；

1.绪论：

植物固着生长的特征使得他们必须去适应环境条件。而近年来，它已不再被视为单独生活的生物，而是成为了“共生功能体”的一个组成部分，“宿主和共生菌群”与相关微生物在植物适应和生存中起重要作用。自然生态系统中的大多数甚至所有植物中，都有相关的大批微生物，尤其以内生真菌为代表（彼得里尼1986年，例如参见[2]）。内生真菌可能是菌根或非菌根，后者主要是子囊菌，包括多组异质性草内生真菌的麦角菌科内生菌。根据Brundrett[3]，菌根不同于非菌根，因为它们需建设一个专门的接口，以用来和宿主之间传递营养物。此外，菌根真菌的发展受限于根，而非菌根植物内生菌却可能成长为根（如黑暗隔内生真菌（DSE）[4]）或茎叶系统的一部分，甚至两者均有[2]。

非菌根真菌的多样性和丰度很高，当考虑每种真菌的数量时，在同一个种群、植物个体或器官中这个数据都会变得非常的巨大[2]。尽管它们普遍发生，然而无论是消极还是积极的生态作用和内生系统，我们都知之甚少。积极的作用主要包括生物对非生物胁迫应激耐受力增加以及植物个体生长，通常被归因于营养吸收的调节，植物激素和抗氧化反应调节[5–7]。此外，一些内生菌，在紧张的环境中能促进宿主生长和适应生存栖息地并与之共同生长，而其他类型菌却没有相应的能力[2]。

植物内生菌的研究主要是在水环境中对陆地植物的影响，以及它们对水生宿主的作用效果，但依然相对较少为人所研究[8]。

在目前的研究中，把分离培养方法应用到植物水薄荷茎和根中的内生真菌进行淹没影响分析（水薄荷）。这种植物是一种兼水生植物，已被用于监测水生态系统质量[9]。它是在人工湿地对水生植物净化一个很好的研究对象，因为它提供了大根面供支撑有益微生物的生长和分泌的物质，可以抑制大肠菌群[10]根际。此外，水薄荷能忍受长期干旱条件，如典型的季节性淹没的湿地和间歇流[11]。

由于体外水薄荷的增长和发展研究甚少，我们评估其内生真菌用于体外培养拟南芥的影响主要从一下几个方面：

（1）水薄荷内生菌对植物生长总体影响是积极，中性的还是负面的？

（2）植物生物量受真菌相关的根表型的影响？

（3）从根或芽中分离的内生真菌对拟南芥的生长反应有差异吗？

这项研究合理的使用非寄生植物，由拟南芥的固有特性，并通过大量的非菌根共生微生物进行试验[12-15]，从而成为植物内生相互作用感受性调查的一个模型[16，19-4]。此外，是为了数据集扩充，对模型和原生植物中获得的结果已显示出相似性。

2.材料和方法

2.1 内生真菌分离

茎内生真菌的分离（茎菌）和根（根菌）的分离：在瓦莱锋迪德蒙特，库内奥，意大利（44°18.3500N，7°22.2960E；海拔680米），采集生长在流动河水边的20株水生菜类植物为样品。规定每人每天采集五个活体样本，但没有特定的植物种类限制（意大利皮埃蒙特）。该领域的研究并没有涉及濒危或保护物种。三条（长4–5厘米）为每个植物和器官的类型进行了流动的自来水中洗涤至少两个小时，然后温育在4％的PPMtrade;（体积/体积）水的溶液1小时。此后，茎段外植体，用70%乙醇消毒90 s、40%漂白粉加0.01%吐温20分钟；根进行消毒，用95%乙醇30 s、6%漂白粉加0.01%吐温20 2 min和2%氯胺T（w/v）在水中加0.01%吐温20为10分钟。在蒸馏水洗涤五次后，根和茎片切成10毫米长的段，在麦芽汁琼脂镀（MEA）中23plusmn;1°C培养。真菌菌落分离纯培养收集的气生菌丝体，并根据其形态和生长速率对不同菌株进行筛选。将消毒的根或茎组织在消毒过的马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上检查消毒效果。水薄荷植物内生菌生长和维持MEA中传代培养，并定期传代。

2.2 内生真菌的分子鉴定

真菌菌丝体刮在MEA培养基上，在25°C 黑暗中培养2周，用研钵和杵液氮细粉把纯培养刮掉。用QIAGEN试剂盒按照制造商的说明来提取总DNA。 其区域与引物ITS1F / ITS1 [20]和[21] ITS4扩增。在25mu;mg/L反应体积下进行聚合酶链反应。将PCR产物纯化，并通过Macrogen公司（阿姆斯特丹，欧洲）测序。进行序列组装和Geneious v编辑8.1.2 [22]，然后提交到GenBank编辑。使用数据库进行片段查询搜索，以揭示关系，发表序列。

2.3 植物材料和生长条件

植物内生菌的体外评价对拟南芥Col-0生态型的影响。种子表面消毒，用75%乙醇90 s和10%漂白粉加0.01%吐温20约5分钟，后用蒸馏水洗涤五次，种子播种和生长在含有0.2times;MS培养基[23]通过添加0.5％的肌醇（重量/体积），0.02％的甘氨酸正方形琼脂平板（120times;120times;17mm）的（重量/体积），0.5％蔗糖（w/v的）（pH值校正到5.7，用NaOH），并在7plusmn;1℃培养72小时。此后，将植物放置在植物生长室中的6小时光照交替黑暗，150微摩尔M-2 S-2的光强度，以及23plusmn;1℃的温度18小时的光周期。板置以70°的角度，以允许沿着琼脂表面根系生长和促进下胚轴的空中生长。

2.4 植物和真菌共培养

用无菌打孔器切两菌丝（直径7mm）于无菌条件下置于4日龄发芽拟南芥幼苗（每板13苗）根尖7厘米的距离。确切塞定位在之前的实验确定，以尽可能避免真菌菌丝体和生长植物之间的任何接触。在形成孢子青霉菌株的情况下，真菌孢子在相同的位置的菌丝体塞与内部在琼脂培养基芯两个孔无菌吸管接种密度106（每次50微升）。用封口膜密封平板。 菌处理植物由8板培养每个内生真菌，并在两个不同的采样周期分析：14和21天。控制板用MEA培养基或100微升无菌水的塞接种。内生真菌处理的植物（菌处理）和控制在用于发芽的相同条件下培养和分析14天和21天。

2.5 植物鲜重和干重

处理测定四组的三个植物。收获后立即擦干，植株上的纸巾去除多余的琼脂和水，称量鲜重（FW）记录于分析量表。植物干重（DW）是干燥的植物材料通风炉中在60°C至恒重后得到的。在允许的植物材料冷却至室温在干燥器测定DWs值。

2.6 根系形态

整个植物图片是用爱普生扫描仪V300扫描仪（爱普生美国、美国）在600 dpi的分辨率，使用Adobe Photoshop软件（Adobe系统公司，美国）并保存TIFF格式。在每次取样时，探索评估根系统生长介质，根区域和根深度测定的能力。测定根部区域被包括在具有20毫米宽的矩形帧中的总根表面上;每个处理五帧进行分析。每个帧内，根系深度测量为突起上的根颈和较远端根尖（S1图）之间的距离的Y轴的长度。图像用ImageJ的1.48V处理。

根系统架构（RSA）于展示给控制和在两个采样时间的关系在FW和显著改变菌处理14天。总数和一阶侧根长度和初生根的长度在每次处理6的植物进行测定。初生根分枝计算为出现分支管的数量和初生根长度（mm）之间的比值。

2.7 统计分析

与对照组比较数据的变化和用画在R的盒状图表示（版本3.1.2）。植物鲜重和干重的变化值，干重百分值、根区和根深度的变化也提出了茎内生（茎菌），内生菌根（根菌）和所有的真菌。通过方差分析在R package multcomp实现均值多重比较Dunnett的检验进行控制和菌处理后之间的差异的意义。在一个概率水平的P＜0.05的差异被认为是显着的。均衡的差异，生物量和RSA参数对数变换。干重百分比数据转化为正弦平方根比例分析。找根形态参数和植物生物量之间的相关性，线性回归分析（R2）在14和21天进行平均值。

3.结果

3.1 水薄荷植物内生菌的分子鉴定

根据其形态和生长特性选出19株。 经过ITS序列数据分析得出，其中17株是不同的，有九株真菌显示出与GenBank（表1）的序列100％的同一性，并对应于以下种类：Aureobasidium pullulans (de Bary amp; Louml;wenthal) G. Arnaud (SE), Cadophora luteoolivacea (J.F.H. Beyma) T.C. Harr. amp; McNew (SA, SL), Cladosporium halotolerans Zalar, de Hoog amp; Gunde-Cim. (ST2), Colletotrichum destructivum OGara (SL23), Nemania serpens(Pers.) Gray (RT6c), Penicillium resedanum McLennan amp; Ducker (RL3), Penicillium solitum Westling (RT5a), Sarocladium strictum (W. Gams) Summerb. (SS).

两种真菌，Cadophora luteo-olivacea（SA和SL）和Nemania serpens（rt6c和rt9）包括两株（表1）。ITS序列的分离rt9的区别只是从N. serpens rt6c一个核苷酸的分离被认为是同一物种。在P.solitum及相关类群中，其区域是高度保守的[ 24 ]，因此对分离的rt5a进行精确归类在仍待研究。

3.2 植物鲜重和干重

从14和21天两组（图1a和1b）看出，不同内生菌对拟南芥鲜重的影响差别很大，并且表现出促进或抑制植物生长的显著影响。

拟南芥与真菌SS和RT6c分别共培养，相较下鲜重增加约30％，而SE，SL，SO，ST2，RL3和RT5a则显著降低植物鲜重（图1a）。最高抑制了约67％，是由诱导RT5a真菌分离物，而其它真菌对植物生物量的减少量介于29和49％之间。

只有少数的内生真菌同时影响了14天和21天的鲜重；他们是：SS，它大大增加了鲜重，而SE、SL，RL3和rt5a，则对它是降低鲜重的影响（图1a）。一些真菌菌株则只对21天的鲜重有增加（SB和rt5b）或减少（RT10）的影响（图1a）。我们发现第一采样和第二次之间有一个明显的相关性（R2 = 0.396；P = 0.002）且鲜重汇总数据的分析并没有发现任何明显的差异之，但与对照组（图1a和1d）相比略有下降。

水薄荷植物内生菌以不同的方式影响拟南芥的干重。事实上，大多数真菌菌株对14和21天的干重有显著增加或没有什么影响（图2a和2b）。这导致干重普遍增加有了数据证实（图2c和2d）。所有分离株对14天的干重有明显的增加（SB，SL23，SS RT5b和RT6c）并在21天显示出相同的效果，其他（SA和SS）则只对21天有明显的（图2a和2b）增加作用。除了分离RT5a，没有内生真菌有对14天拟南芥的干重有显著下跌的影响，而3株除了RT5a，即SL，SO和RL3，对21天干重有明显的减少。获得的数据看出21天和14天的结果有严密的相关性（R2 =0.578，P = 0.000）。

总体而言14天和21天的鲜重和干重传递均显著增加了的真菌有三株（SB，SS和RT5b），并其它三个（SL，RL3和RT5a）则使21天的都降低（图1和2）。在后者，RL3和RT5a早期孢子和菌丝大量生长，根本无法测量的根源

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