运用组蛋白质分析方法研究个体发育以及饮食相关的变化对于幼年响尾蛇和成年响尾蛇的毒液成分的影响外文翻译资料

 2023-01-10 16:17:19

运用组蛋白质分析方法研究个体发育以及饮食相关的变化对于幼年响尾蛇和成年响尾蛇的毒液成分的影响(Sistrurus miliarius barbouri)

原文作者：H. Lisle Gibbsa, Libia Sanzb, James E. Chiucchia, Terence M. Farrellc, Juan J. Calveteb

摘要：蛇毒蛋白在个体水平上显示出了高层次的变化，然而环境和产生这种多样性的分子机制尚不清楚。在这里，我们报告通过控制摄食实验结合定期收集毒液样本来评价个体发育饮食方面的影响对于已捕获的幼年响尾蛇和成年响尾蛇的毒液组成的影响的实验结果。由于主要类别的毒液毒素的相对丰度的物质变化，幼蛇自出生后被喂食以老鼠、蜥蜴和青蛙不能表明幼蛇在5到26个月大时的毒液成分的变化是由于个体发育所引起。然而，在相对丰度为D49-PLA2 15, PI-SVMPs,和 PIII-SVMP 28时会产生细微的变化，并且在丰度为PIII-SVMPs的情况下会引起毒液毒素的下降。尽管那些被不同的捕蛇者饲养的幼蛇在26个月大的时候展现了明显的相对毒素组成变化率，它们的毒素表明了相似的蛋白成分，这意味着饮食方面的影响对于蛇在这个阶段或更幼年时的毒液形成大体上是没什么作用的。相反，在来自最初和最后的主要蛋白质家族样本的相对丰度方面，由不同的捕蛇者饲养的成年雌蛇在经历了26个月之后显示出与饲养者相关的变化。准确地说，用老鼠饲养的雌蛇在总95%的PLA2s和大于100%的丝氨酸蛋白酶上的相对丰度增加，而以蜥蜴（22%和-42%）和青蛙（2%和11%）饲养的雌蛇相对来说在体型上明显要小得多。由不同捕蛇者饲养的成年蛇的毒液同样也在分别用老鼠、蜥蜴和青蛙饲养丰度分别为PLA2，分子15,19a和19，浓度分别对应(gt;100%, 33%, 63%)、(gt;100%, 0%, 35%)和 (71%, 20%, minus;4%)表现出明显的差异。用青蛙饲养的蛇的毒液中含有和小的（1.1%）但是一致量的PLA2分子（15a），而这种成分在其他两种蛇中并不存在。这项工作表明，蛇毒液的形成在一定程度上是可塑的，无论是幼蛇还是成年蛇，并且至少成年蛇由于消耗的猎物不同会影响不同功能的蛇毒蛋白的相对丰度。

关键词：侏儒响尾蛇 barbouri；个体发育的毒液变化；饮食相关毒液的变化；蛇毒蛋白质组学；质谱分析

1.引言

在毒蛇的家族里，蝰科和眼镜蛇科毒蛇会产生一种复杂的混合物，它们利用毒牙将毒液注入猎物，这种毒液由不同的有毒蛋白质组成，在上颌骨的专门的毒液腺中形成。毒液代表营养适应性特征，对蛇来说是觅食成功的关键。蛇毒蛋白会进行加速进化，毒液成分在属、种、亚种、种群和个体水平方面的变异可以赋予蛇以适应不同生态位的能力。蛇毒蛋白分析（SVPS）使用蛋白质凝胶电泳一直显示高内和种间变异的水平（供审查见[ 3 ]），虽然现在不多但有越来越多的研究强烈支持这种观点：这种变异反映了摄食不同猎物的环境适应能力。有一些间接的证据表明，这种变化是在遗传控制下进行的，也许是由于导致氨基酸改变的替换毒液基因或者是等位基因的存在或缺失该代码的特定毒液蛋白。然而，有也有证据表明，个别毒液组合物的可塑性可能是通过时间由于基因的影响规制。最重要的是，许多蛇显示与年龄相关的毒液成分的变化。虽然所观察到的变化的功能意义仍然不清楚，但这种模式被解释为反映个体基因表达变化可能与饮食差异有关，比如同一物种中的幼蛇（例如变温猎物如青蛙和蜥蜴）和成年蛇（如恒温猎物的哺乳动物）。最近，对于相近物种之间的毒液转录物组的分析记录了在相同或不同的蛇群中，基因表达而比较的高效液相色谱法产生的毒液型材在一个特定的蛋白质的量上面的大的差异。

大部分评估毒液成分可塑性的程度和起因的工作依赖于间接证据例如不同年龄阶层的蛇的毒液成分之间的比较或个体由不同的猎物饲养的蛇的毒液成分之间的比较（见上）。然而，已经有一小部分的实验使用了控制变量实验来检验年龄和饮食等具体因素对个体的作用，他们使用详细的蛋白质组学为基础来分析特定蛋白质丰度的变化。从老鼠身上我们发现饮食对于通过自主神经分泌唾液分泌物的成分是有直接影响的，神经系统和质谱为基础的蛋白质组学分析最近已被用来量化特定的变化在这些研究唾液酶。鉴于蛇的毒液腺是由无毒的祖先类群经唾液腺进化而来的，通过自主神经反馈回路导致在特定的SVP表达模式的变化是可能的，尤其是当蛇长时间的吃某种特定的猎物。为了探索这种可能性，在这里，我们将展示经过我们长期实验得出的结论，对幼年和成年的响尾蛇(Sistrurus miliarius barbouri)用不同的猎物经过连续26个月的喂养，之后根据Sanz和Gibbs的介绍，他们使用蛋白质组学的方面检测到了蛇体内的蛇毒成分的变化。

Sistrurus m. barbouri是一条小的北美响尾蛇（平均长度为53.5厘米），他们是在乔治亚州的南面、整个佛罗里达州、亚拉巴马州的西到南方以及密西西比河被发现的。它们的食物主要由变温动物如青蛙和蜥蜴组成，偶尔也会捕食一些小的哺乳动物。有证据表明这会对正在发育中的幼蛇的毒液成分产生影响，对成年蛇的毒液成分产生调整作用，但无论在哪种情况下，毒液的可塑性都与猎物是相关的。在这里，我们使用实验的方式，包括给蛇提供特定的食物很长一段时间（26个月）来探索饮食对于幼蛇和成年蛇在调节毒液成分可塑性方面所充当的角色。我们也使用毒液的详细的蛋白质组学分析（参见“蛇组学”–[ 35 ]）确定的丰度通过时间的变化的SVP的主要类别。

2.实验过程

2.1 蛇的野外采集和特定的猎物处理

2008年八月，在佛罗里达州的迪兰附近，通过搜寻之前研究过的开阔的平原栖息地，我们收集到了一些妊娠期的成年雌响尾蛇。我们运回了6条雌蛇到俄亥俄州立大学的实验室，并在一到三周的时间内捕抓了一窝3-7岁的幼蛇。在接下来的几个月里一条雌蛇和几条幼蛇不知何种原因死亡了---验尸结果表明没有任何病症或者压力方面原因的迹象。成年蛇被单独安置在爬行动物的笼中而幼蛇被单独安置在小的塑料容器中。所有的蛇都放在同一个照顾动物的温度保持80摄氏度，湿度保持75%的房间中，并且提供水和自由采食。在2周的捕获时间内，雌蛇被分成了三个小组，它们有着不同的食物：实验老鼠(Mus musculus) （从 www.

frozenrodents.com这个网址上买来的），棕色的变色蜥蜴 (Anolis sagrei) ，收集于佛罗里达州的迪兰附近的区域以及绿色的树蛙 (Hyla cinerea)，通过商业购买而得。蛇的所有食物都是已经死亡的但拿给蛇之前还是热的。从捕捉开始的26个月的期间里，大概以一个星期作为时间间隔，只有雌蛇被喂以这些食物。在应用了Gibbs等人的方法之后，从雌蛇被捕获的那天起大概每隔2个月的时间它们的毒液样本会被收集一次。在每次毒液提取的时候我们也会一并采集长度和重量的数据。幼蛇也被分配特定的猎物作为食物，年轻蛇最初被喂以匀浆猎物或者猎物身上的部分直到它们原意食用整个猎物。由于它们很小，在5个月大之前我们没有提取它们的毒液。我们承认，分析比5个月小的蛇的毒液成分，随着时间的推移，可能可以观察到毒液成分的显著变化。对于成年蛇也是一样，从那个时候开始，大概以2个月为间隔提取蛇毒，并同时采集长度和重量方面的数据，一直到幼蛇长到26个月大为止。

2.2毒液分析

正如我们所描述的，我们分析了成年蛇和幼蛇的毒液组成。最初，我们用两种方式来分析毒液：第一种，提取特定喂食方案的每一个体的等量毒液，比较经过区别对待之后的每一种毒液，第二种，分别用上述方式分析每一种毒液然后分析相应方面的信息。我们专注于第一种分析方式得出的结论因为它们的小样本尺寸和多个体解释剖面样品。然而，两种分析方式得出的结论是相近的（Gibbs等人并没有公布这些数据）。

为了分析毒液样本，由等量的个体样本溶解在0.05%三氟乙酸100 mu;L（TFA）和5%
乙腈中，并和不溶性物质通过离心除去，在13000 times;g室温保持10 min制成2 mg的粗毒液。将可溶性的毒液蛋白通过反相高效液相色谱法使用eknokroma欧罗巴C18（0.4 cmtimes;5mm粒径25 cm，300Aring;孔径）柱和安捷伦LC 1100高压梯度系统配备DAD检测器和微型自动进样器分离。流量设定为1 ml/min，柱随着0.1% TFA水线性梯度（解决方案开发A）以及乙腈（方案B），溶剂（10%B）10 min，其次是10-25% B 20 min、25-45%B 120 min和45-70% 20 min。蛋白质检测在215 nm的条件下进行，参考波长为400 nm。色谱馏分被分配了之前Sistrurus m. barbouri的蛇毒蛋白，通过保留时间和SDS-PAGE，序列的N-末端Edman降解（使用高精度仪器，应用生物系统，福斯特城，CA，USA），胰蛋白酶肽质量指纹，同位素平均分子量采用电喷雾电离质谱（ESI）质量的测定使用Applied Biosystems QTRAPtrade;2000质谱在增强的多电荷模式操作的光谱仪范围m/z 600 - 1700来进行分析。在少数情况下，会有新蛋白质被观察到，这些被确定的N-末端和ESI-MS的氨基酸序列的相似性搜索，与利用BLAST程序在搜索引擎http://www.bork.embl-heidelberg.的dewublast2中可获得的数据端搜索不同。鉴于该肽键的吸收波长在190和230 nm的范围内，在215 nm的条件下检测蛋白质可以估计不同毒液毒素的相对丰度（表示总毒液蛋白的百分比）和蛋白质家族（从关系的总和的地区的含蛋白质的反相色谱峰和从同一个家庭的总面积的毒液蛋白峰的反相色谱克）。在严格意义上，根据以Lambert-Beer定律，计算出的相对量应当对应于样品中的总肽键的百分比，这是对一个特定的毒液成分通过质量百分比来计算的不错的估算方法。反相高效液相色谱法通过X和不断重叠的乙腈梯度分布，从而使所有的色谱图毒液样本和饮食组之间直接相比较，通过时间以评估特定蛋白质的丰度变化。

高效液相色谱法测定幼蛇和成年蛇的毒液，用眼睛和程序Metacomps（P. Nuin,编写）来比较这两种毒液，在他们的保留时间（逆转录）值的基础上匹配不同样本的峰值。这使得我们能够把色谱峰值与之前按时间顺序收集的蛋白质的特征相对应起来。比较了已知特定的蛋白峰的值，允许我们通过时间能够评估在特定的猎物饲养下个体毒液的丰度变化。我们分析了五个主要蛋白质的丰度数据，他们占了侏儒响尾蛇毒液的大部分（90%左右，见【29】）蛋白成分（见图1和图2），包括明显并且容易测评的去整合素（峰6–9）、磷脂酶A2蛋白（PLA2s，峰15a，15，17，19A，19），富含半胱氨酸的分泌蛋白（CRISP,17峰）、丝氨酸蛋白酶（峰20–25）、蛇毒锌依赖性金属蛋白酶（酵素）（峰26 - 31）、在选择单个蛋白峰的变化的PLA2s（15，19A，19）以及酵素（28a，28，29，30）。

3.实验结果

3.1随着个体发育蛇毒成分的变化

图1和图2展示了在5到26个月的分别用老鼠（图1）、蜥蜴加青蛙（图2)饲养的幼蛇毒液样本中毒液成分的变化。根据毒素的相对丰度变化，无论是主类还是特定蛋白，表1总结了第一个和最后一个的样本中所有被对应饲养的幼蛇的毒液的变化。可能的主要类别的蛋白质除了CRISP毒素在总体丰度方面并没有太大的变化（任意定义为ge;50%变化，在所有的培育过程中，表现为持续下降，在用青蛙喂养的幼蛇增加了大于100%的整合素。然而，个体毒素的丰度显示出了很大的变化：具体而言，在所有的培养过程中，PLA2 15峰值表现出大幅增加，类似于PI蛋白酵素和piii-svmp和峰值为28一样。以不同的猎物饲养的幼蛇变化的PLA2 15的总量是不同的，最高的是用青蛙饲养的（从0.1%到5.6%），其次是用蜥蜴喂养的幼蛇（0.1至2.5%），而最低的是用老鼠喂养的幼蛇（1.8至4.4%）。相类似地，对于PIII-SVMP 28峰相对大小的变化，变化最大的也是用青蛙喂养的幼蛇，而其他两种幼蛇的变化则相对较少。值得注意的是，尽管三种饲养方式下幼蛇的PIII-SVMP 28的增加是与所有其他的PIIISVMPs的相对丰度减少是同时发生的，但对幼蛇喂以恒温动物和变温动物时，这种转变的速度是有区别的。因此，28峰代表了从出生起用老鼠养到9个月大的幼蛇的多数PIII-SVMP的毒液（图1），而那些用蜥蜴养大的幼蛇的毒液是仅仅15个月之后的（图2 ）。

当计算所有毒素类的平均值时（一般和具体的），那些用青蛙饲养的幼蛇（47%）变化的绝对值最大，其次是用老鼠（36%）饲养的幼蛇和用蜥蜴（30%）饲养的幼蛇（表1）。最后，从PI到PIII的金属蛋白酶的丰度的比例在随着时间的推移过程中，无论是何种饲养方式其比例都得到了增加，其中最多的是用老鼠饲养的幼蛇（从初始的0.11到最后的0.30），其次是用蜥蜴饲养的幼蛇（从初始的0.11到最后的0.20），最少的是用青蛙饲养的幼蛇（从初始的0.07到最后的0.11）。总的来说，我们的研究结果表明，在侏儒响尾蛇个体发育的过程中的毒液变化不包含多数毒素的实质性变化而是在每一大类特定的成分中的一些细微的变化。此外，尽管我们的样本容量是有限的，在这些细微的差别中似乎有一些与饮食相关的区别。以色谱馏分的方法，对最初指定的保留时间和SDS-PAGE分析和之前鉴定的毒液蛋白，由N端测序、胰蛋白酶肽质量指纹图谱和电喷雾质谱（图3）进行验证。此外，峰值19A，没有在侏儒响尾蛇的毒液蛋白质组出现过，那些用三种培育方式收集来的九个月大的幼蛇的标本的相对丰度突然增加

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