毛喉鞘蕊花（唇形科）的细胞遗传学研究：一种药用植物外文翻译资料

 2023-01-10 16:17:27

毛喉鞘蕊花（唇形科）的细胞遗传学研究：一种药用植物

原文作者 Aryane Campos Reis，Lyderson Facio Viccini，Saulo Marccedil;al de Sousa Universidade Federal de Juiz de Fora

摘要：唇形科药用植物毛喉鞘蕊花的研究，现在主要运用了细胞遗传学方法和流式细胞技术（FCM）。在本文中，我们首次描述了染色体组的细节，包括染色体形态、GC条带的物理图谱（CMA条带），及45S和5S rDNA位点。所有研究分析显示染色体组为2n=30，包括30条较小的中间着丝粒和亚中间着丝粒染色体。CMA条带和荧光原位杂交技术揭示了CMA条带和45S rDNA位点之间重合的6个终端标志，而5S rDNA和CMA条带则观察到4个不重合的金末端标志。核基因组大小经测量通过流式细胞术得出柱状图，G0/G1的峰值CV在2.0~4.9之间，而提供给该物种的平均值是2C=2.78pg，AT%=61.08，GC%=38.92。这里获得的细胞遗传学数据呈现了一些新的重要信息，丰富了毛喉鞘蕊花的表征。

关键词：AT/GC含量；染色体数目；异染色质基因组大小；分子细胞遗传学

引言

Plectranthus L Herit.（唇形科）包含近300个种，分布在热带非洲、亚洲、澳大利亚和巴西（Lukhoba et al. 2006，Alasbahi Melzigh，2010）。许多物种显示重要的药用性能，在形态学、化学以及染色体数目方面有较大变异，染色体数目变化从2n=14到2n=84（Morton，1962，De Wet，1958，Lukhoba et al. 2006，Alasbahi and Melzig，2010）。

Plectranthus barbatus Andr.作为最重要的一种常用于民间医药的物种之一，显示出了较多的形态学变异，也常被引用为许多别名，例如P. forskohlii Briq.，P. forskalaei Willd.，P. kilimandschari (Guuml;rke) H. L. Maass.，P. grandis (Cramer) R. H. Willemse，Coleus forskohlii Briq.，C. kilimandschari Guuml;rke ex Engl.，C. coerulescens Guuml;rke，C. comosus A. Rich.，和C. barbatus (Andr.) Benth (Lukhoba et al. 2006，Alasbahi and Melzig，2010)。

一般而言，P. barbatus主要用于肝脏紊乱、呼吸系统疾病、心脏病和某些中枢神经系统疾病，也被用作降血压和抗痉挛药（Alasbahi and Melzig，2010）。由于这些广泛的应用，大量的化学和药理研究显示毛喉素（也称为毛喉萜）是其主要活性成分（Lukhoba ea al. 2006，Alasbahi and Melzig，2010）。

尽管较多的关于该物种的药理研究和一些生物状态方面的研究已经完成。考虑到P.barbatus的药用价值和大量已报道的变形或变种，其基本信息如染色体核型特征是非常重要的，且有助于进行正确的植物学鉴定及商业化品种的育种程序（Sousa et al. 2009，Ferreira et al. 2010，Sousa et al. 2010，Pierre et al. 2011，Sousae et al. 2012，Sousa et al. 2013，Reis et al. 2014，Viccini et al. 2014）。目前为止，关于细胞遗传学的研究，只有一些染色体数目和减数分裂行为方面的报告（De Wet，1958，Morton，1958)。而详细的数据如染色体显带和分子细胞遗传学特征不适用于Plectranthus。

当前工作的目的是通过使用染色体显带和分子细胞遗传学技术为P. barbatus描述新的染色体标记。通过较低的流式细胞术，基因组大小和AT/GC含量也有助于描述P. barbatus的不同的同源染色体的表征，以及理解Plectranthus的分类和进化。

材料和方法

植物材料

五种采自巴西东南部Minas Gerais，Juiz de Fora（21°4551'S，43°2101'W），以及迪福联邦大学温室中培养的Plectranthus barbatus。每个有记载的植物凭证标本存放在迪福联邦大学的中欧科学期刊植物标本室的相应号码如下：PB 2324，PB 2325，PB 2326，PB 2327，PB 2328。

有丝分裂的息差的制备

取适量根尖材料用0.003mol/L的8-羟基喹啉在室温下处理7小时，然后在乙醇和乙酸混合液(3:1)中于-20℃固定24小时。再将根尖分生组织用酶液（4%果胶酶:40%纤维素酶）于37℃浸制5小时。这些过程的准备的根据来源于Carvalho and Saraiva（1993,1997）。

测定染色体形态参数

对5种材料通过较好地扩展得出的中期相使用CellSens软件（Olympus，日本东京）进行分析，得出染色体长度、短期和长臂和染色体臂之间的比率(AR)等数据。染色体分类是根据Levan等人的方法完成的(1964)。表意文字根据着丝粒指数绘制，根据递减的大小顺序排列。

分子细胞遗传学

采用从小麦中获取的探针pTA71进行荧光原位杂交（FISH），其中包含一段9kb的EcoRI片段包括18S-5.8S-25S rRNA基因和基因间隔序列（rDNA）（Gerlach and Bedbrook 1979），以及从Dr.J.Jiang提供的玉米中获取的5S探针（D.-H. Koo and J.Jiang，威斯康星大学，未发表数据）。每个探针都通过缺口移位进行地高辛标记，然后根据Jiang等人（1995）的方法经过一些小改装进行杂交。杂交混合物在85℃中变形10min，并立即转移到冰盒中。组织材料则在85℃变性处理1min，然后进行一系列的酒精清洗（70%，90%，70%的乙醇溶液，每次5min）。再将杂交混合物加入到组织材料中，使染色体在37℃的可调湿度室中进行杂交。杂交后用2times;SSC buffer（0.3mol/L柠檬酸钠，0.03mol/L氯化钠，pH=7)和1times;PBS buffer（0.3mol/L氯化钠，0.27mol/L氯化钾，0.1mol/L磷酸氢二钠，0.2mol/L磷酸二氢钾，pH=7.4）。探针用抗地高辛结合物检测，用罗丹明红色荧光染料（sigma）染色后，用1times;TNT buffer（0.1mol/LTris，0.15mol/L氯化钠，0.05%Tween-20）和1times;PBS在室温条件下清洗。染色体用2mu;g/mL的DAPI（Sigma）复染色。组织材料放在Vectashield抗荧光衰减剂中保存（Vector，Burlingame，California，USA），一些样本则经100%乙醇褪色后再杂交24小时。良好的中期分裂相用奥林巴斯DP72数码相机捕获，将带有DAPI蓝色荧光的图像，45S和5S信号 用CellSens软件进行融合（Olympus，Tokyo，Japan）。染色体观察使用带有合适滤波器组的数字化荧光显微镜（奥林巴斯BX 51）（Olympus，Tokyo，Japan）。

染色体分带

染色体分带根据Schweizer（1976）的方法进行。成熟的材料组织用色霉素A3（0.5mg/mL）染色1小时，远霉素（0.1mg/mL）染色30min，2-4脒-2-苯基吲哚（2mu;g/mL）染色30min。组织材料保存在麦克凡式磷酸盐缓冲液（pH=7.0）与甘油的混合液（1:1=v/v）中。对此分析每种材料的5个分裂中期相，用奥林巴斯DP72数字相机观察并记录。染色体观察使用带有合适滤波器组的数字化荧光显微镜（奥林巴斯BX 51）。

流式细胞技术（FCM）

核DNA含量根据Galbraith等人（1983）的方法进行。P. barbatus的5种材料分别取20-30mg的新鲜幼叶，取以幼叶组织为标准的等量的玉米CE-777，在冰盒中磨碎后用1mL 的OTTO I细胞溶解缓冲液溶解（Otto 1990），并加入50mu;g/mL的RNAse。悬浮液用40nm的过滤网滤过后，加入到2mL的微量离心管中，以1,100rpm的速度离心5min.离心后的颗粒用100mu;L的OTTO I磷酸缓冲液保温处理10min，然后加入到1.4mL的OTTO I: OTTO II (1:2=v/v)的缓冲液中。样品均匀分成颗粒并用50mu;g/mL的碘化丙啶（PI）染色从而确定DNA总含量。AT/GC的组成比通过在样品中加入4mu;g/mL的DAPI（4,6-脒-2-苯基吲哚）来测定。每个样品在FACSCantoII（BectonDickinson）流式细胞仪中至少对10，000个细胞核进行分析。直方图分析使用了流式2.5.1软件。(http://www.lowingsoftware.com)

每个样本的核DNA数量（pg）是通过样本的相对荧光强度和内部参考标准（玉米5.43）。每个样本按照方程测量3次（Dolezel 2003）。

样本DNA含量=

PIFI是用碘化丙啶染色的细胞在G1期的荧光强度。

P. barbatus的AT比值以玉米的参考标准来测量，根据Godelle等人（1993）的方程式。

其中R是P. barbatus和玉米的荧光强度的峰值之比，r（整合长度）=3DAPI染色（Meister and Barow 2007）。互补碱基的比例是按照GC%=100-AT%计算的。

结果

所有的材料都显示出对称的染色体核型，2n=30。14条染色体显示着丝粒在中间（m，AR=1-1.7），其中一条在亚中间区域（sm，AR=1.71-3.0）（表1）。没有观察到次缢痕。染色体的长度范围为2.51-1.86mu;m（表1），染色体核型公式（KF）是KF=14m 1sm。

染色体相对长度显示较大的染色体约占7.91%的基因组大小，最短的占5.86%（表1）。

45S rDNA信号在3对染色体的终端部分观察到（两个在6号和10号染色体的短臂上，一个在11号染色体的长臂上）（图1 B1-B3），而5S rDNA信号则在接近端点两队染色体上观察到，分别在9号染色体和12号染色体的短臂上（图1 A1-A3）。45S rDNA位点与5S rDNA位点相比，在观察上显示出较大的联系，表现为成对的小点（图1 A2-A3和B2-B3）。

没有观察到着丝粒、间质或终端的DAPI条带。然而，CMA3的荧光染色显示3对染色体之间的联系，也是DAPI所否定的。异染色质占到总的单倍体补体的0.37%。条带观察显示相似的大小和明亮程度，都位于终端区域并符合45S rDNA标记，分别为6号和10号染色体的短臂以及11号染色体的长臂上（图1 C，D）。没有在任何染色体中观察到其它的CMA条带。

关于核基因组大小的估计，流式细胞术（FCM）技术提供了高质量的直方图，G0/G1峰值显示CV=2.0-4.9。该物种的2C DNA含量估计为2C=2.78pg（表1）。考虑到1pg=978Mpb（Dolezel et al. 2003），结合流式细胞术和细胞遗传学数据，最大的染色体（1号染色体）对应107.452Mpb（~7%的基因），而最小的一个（15号染色体）对应79.605Mpb（~6%的基因）。通过使用FCM，测出P. barbatus基因组（2C）共拥有2714.148Mpb（表1）。

此外，PI和DAPI荧光染料首次估计了P. barbatus基因组的碱基组成。碱基的比例分别是AT为61.08%，GC为38.92%。代表DNA含量的直方图和碱基组成可见于图1E.

讨论

Plechtrantus属的染色体数目变化较大。尽管绝大多数物种的染色体基数是x=7，二倍体染色体数目是28，仍有一些物种显示出其它的染色体基本数量（6和8）（De Wet 1958, Morton 1962）。此外，在该属中，种内染色体数目变异较为常见。Morton（1993）所述，例如，以下非整倍体数：对于P. assurgens（Baker）J.K.Morton和P. glandulosus Hook：2n=26和28，对于P. tenuicaulis（Hook.f.）J.K.Mort

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