全转录组学方法为埃塞俄比亚阿拉伯按蚊对有机磷和拟除虫菊酯抗性的分子基础提供新视角外文翻译资料

 2023-03-27 17:06:48

全转录组学方法为埃塞俄比亚阿拉伯按蚊对有机磷和拟除虫菊酯抗性的分子基础提供新视角

作者: Louisa A. Messenger a,b,c, Lucy Mackenzie Impoinvil a, Dieunel Derilus a, Delenasaw Yewhalaw d,e, Seth Irish a,f, Audrey Lenhart a,*

摘要

在埃塞俄比亚，疟疾病媒中杀虫剂抗性的发展越来越受到关注，因为它对病媒控制失败有潜在影响。为了更好地阐明抗药性机制的特异性，并促进尽量减少选择交叉抗药性的可能性控制策略的设计，我们使用了一种全转录组方法来探索埃塞俄比亚奥罗米亚地区的多重杀虫剂抗性按蚊群体的基因表达模式。使用Illumina RNA测序法对大量存活和未接触者的个体进行分析，同时设置杀虫剂易感参考菌株，发现该地区的种群对马拉硫磷（平均死亡率为 71.9%）和氯氰菊酯（77.4%）的诊断剂量具有抗性。这个群体还表现岀对溴氰菊酯存在抗性，但对alpha;-氯氰菊酯、苯二甲醚和丙漠磷表现为敏感，这为检测杀虫剂特定的抗性机制提供了表型基础。转录组数据显示，细胞色素P450s、谷胱甘肽转移酶和羧酸酯酶（包括CYP4C36、 CYP6AA1、CYP6M2、CYP6M3、CYP6P4、CYP9K1、CYP9L1、GSTD3、GSTE2、GSTE3、GSTE4、GSTE5、GSTE7和两个羧酸酯酶）基因过度表达，共同存在于马拉硫磷和氯菊酯存活种群中。我们还发现了19个高度过表达的角质层相关蛋白（包括CYP4G16、CYP4G17和甲壳素酶）和18个唾液腺蛋白（包括D7r4短形式唾液蛋白），它们可能分别通过增强角质层屏障或促进杀虫剂的结合和封存来促成非特异性抗性表型。这些发现为这一特征不明显的主要疟疾病媒物种的杀虫剂抗性分子基础的提供了新见解。

关键词：阿拉伯按蚊埃塞俄比亚杀虫剂抗性RNA-Seq拟除虫菊酯类有机磷酸盐

1简介

在全球范围内，自2010年以来，疟疾死亡率已经下降，这主要是由于扩大了诊断、治疗和基于杀虫剂的病媒控制干预措施的范围。然而，由于非洲、东南亚和印度等世界卫生组织地区的死亡率下降2016,速度停滞不前，因此这些地区的死亡率也在下降。

在西太平洋地区，甚至在东地中海和美洲地区也岀现了逆转（世界卫生组织，2020年）。同时，主要疟疾病媒物种的杀虫剂抗药性已变得很普遍，影响到约90%正在进行疟疾防治的国家（世界卫生组织，2020）,并威胁到全世界的病媒控制工作。

在埃塞俄比亚，主要疟疾病媒阿拉伯按蚊对杀虫剂的抗药性在这几十年来一直是一个公共卫生问题。1959年，首次使用DDT进行室内滞留喷洒（IRS），从1997起开始发放驱虫蚊帐（ITN），并在2005年之后不断扩大规模（总统疟疾倡议，2019）。直至2009年检测岀 DDT抗药性，随后的IRS中则用溴氰菊酯取代了DDT,在2011年到2013年的使用之初,溴氰菊酯是与苯迪威联用，随后在不同的地理区域则喷洒苯迪威和丙漠磷。2015年，引进了甲基嘧啶磷，这在现在全国各地正与丙漠磷一起使用（Messenger等人，2017）与此同时，自2008年以来，埃塞俄比亚地区分发了超过8000万经拟除虫菊酯处理的长效杀虫剂蚊帐（LLINs）（总统疟疾倡议，2019年）。这种不同化学品的异质使用导致埃塞俄比亚各地岀现了高度集中的动态抗药性模式，广泛反映了国家杀虫剂政策的纵向变化（Messenger等人，2017；Alemayehu等人，2017）。阿拉伯按蚊种群现在对DDT和溴氰菊酯存在很强的抗性，但伴随着在一些地方对马拉硫磷、甲基嘧啶磷、丙漠磷和苯二甲醚的敏感性降低（Messenger 等人，2017；Alemayehu等人，2017）。L1014F-kdr等位基因的存在首次被报道是在2010年来自于南部的地区，埃塞俄比亚西南部的Gilgel-Gibe水力发电大坝上附近。（Yewhalaw等人，2010）。在这些种群中，L1014F-kdr实际上是固定的，这种靶点突变现在在埃塞俄比亚的其他地方普遍检测到,频率不一（Messenger等人，2017）。在奥罗米亚和Benishangul - Gumuz 地区的一些阿拉伯按蚊种群中也观察到谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）的水平升高（Alemayeh 等人，2017）。到目前为止，其他靶点突变包括L1014S-kdr、N1575Y和G119S-Ace-1，还没有在埃塞俄比亚发现（Messenger等人，2017；Alemayehu等人，2017）。

在奥罗米亚地区，阿拉伯按蚊对历史上用于控制成虫病媒的四种化学类别（除虫菊酯类、氨基甲酸酯类、有机磷类和有机氯类）的杀虫剂表现岀抗性（Messenger等人，2017；Alemayehu等人，2017）。在这一地区，该种群由于预先接触增效剂胡椒基丁醜（PBO）恢复了易感性（Messenger等人，2017；Birhanu等人，2019）,再加上表型抗性与L1014F-kdr频率之间缺乏关联，以及完全没有其他靶位突变（L1014S-kdr；N1575Y和G119S-Ace-1），综上表明代谢机制可能在抗性中发挥重要作用（Messenger等人，2017；Alemayehu等人，2017）。

在非洲按蚊中，一些细胞色素P450单氧酶（CYP450s）、寇酸酯酶（COEs）和GSTs在 功能上与拟除虫菊酯抗性有关（Muller等人，2008a； Stevenson等人，2011；Chiu等人，2008；Ibrahim等人，2016a；Riveron等人，2014）。除了解毒酶，其他基因家族，包括alpha;-结晶蛋白、六聚体蛋白和ATP合成酶（Ingham等人，2018）、Maf-S、Dm和Met转录因子（Ingham等人2017，2018）、D7r2和D7r4唾液腺蛋白（Isaacs等人，2018）、一种感觉附属蛋白SAP2（Ingham等人，2019）和角质层蛋白（Balabanidou等人，2016）已与抗药性有关。虽然这些蛋白的过度表达在不同国家和亚种的冈比亚蚁之间是保守的（Ingham等人，2018年），但关于冈比亚蚁抗性的分子基础的数据仍然相当少，特别是在埃塞俄比亚地区 （Messenger 等人，2017；Alemayehu 等人，2017；Simma等人，2019）。目前，只有 CYP6P4 和GSTD3与当地的溴氰菊酯和DDT抗性有直接联系（Simma等人，2019）。

在埃塞俄比亚，全国范围内的杀虫剂抗性管理战略依赖于不同活性成分的IRS和LLIN 的战术部署。为了使这种战略取得成功，需要清楚地了解对个别杀虫剂的抗性机制的特异性和选择交叉抗性机制的可能性。为了提高我们对阿拉伯按蚊的这些因素的深入理解，我们选取埃塞俄比亚西南部，具有多重杀虫剂耐药性田间种群的阿拉伯按蚊，采取全转录组的方法描述基因的表达模式。

2材料和方法

2.1研究区域和试蚊采集

成蚊采集自埃塞俄比亚奥罗米亚地区的Asendabo（北纬7°40rsquo;rsquo;31rsquo;,东经36°52lsquo;rsquo;56lsquo;）,该地区先前曾报道过，阿拉伯按蚊种群对有机磷酸盐和拟除虫菊酯具有抗药性（Messenger等人，2017）。试蚊取样于当地漫长的雨季结束时，即2017年9月3日至10月10日之间，遵循这一地区2017年6月的美国国税局与国家疟疾控制计划（NMCP）。

在征得住户同意后，于凌晨4点至6点之间，从12所房屋（间隔距离大约 lt; 5 km，的墙壁上使用手持式吸尘器采集了室内休息的、以血为食的雄性按蚊。蚊子饲养与在可以接触到10%蔗糖的纸杯里，并被运到奥罗米亚地区Sekoru的热带和传染病研究中心（TIDRC）（北纬54°50,东经37°25rsquo;236rsquo;）。Fi的后代是由现场收集的蚊子使用强制卵化法生产的（Morgan等，2010）。现场收集到的以血为食的蚊群，形态学上被确定为冈比亚按蚊（Gillies 和Coetzee，1987），饲养4 - 5天，直到完全产卵，每天检查存活情况。每只吸血后完全发育的雌性动物被转移到装有湿棉絮的1.5微升离心管中，让其产卵。来自246只冈比亚按蚊成虫的卵被运到美国亚特兰大的美国疾病控制和预防中心（CDC）,并集中在CDC的昆虫室中饲养。

阿拉伯按蚊Dongola杀虫剂敏感参考品系（源自苏丹，从疟疾研究和参考试剂资源中心获得）和Sekoru杀虫剂敏感的实验室品系（源自埃塞俄比亚，从吉马大学病媒生物学和控 制研究单位获得）（Balkew等人，2010）均在CDC昆虫室中饲养。所有的成蚊都在标准的 昆虫室条件下饲养（27 plusmn; 2 ℃，80%的相对湿度，14: 10小时的光暗循环），用饲养取用10% 的蔗糖溶液。每个品系的F1成年雌性被随机地混合在蚊笼中进行后续的生物测定。

2.2.杀虫剂抗性生物测定

疾病防治中心针对马拉硫磷（有机磷）和菊酯（拟除虫菊酯）的接触筒法生物测定是根据公布的指南进行的（Centers for Disease Control and Prevention, 2012）。将工业级杀虫剂稀释在毫升50丙酮中，制备岀杀死100%易感蚊子所需的诊断剂量（马拉硫磷：50gg /瓶和氯菊酯：21.5曲/瓶）的储备溶液。通过滚动和倒置接触筒，每个250毫升的玻璃接触筒连同筒盖都涂上1毫升的原液。在每次试验中，用1毫升酮涂抹一个对照筒。接触筒在黑暗中晾晒3小时，每次试验前都要彻底清洗并重新涂抹。装有10%蔗糖的接触筒经过2小时的适应期后，大约将20 - 25只饥饿处理的，羽化3天的冈比亚成虫引入每个接触筒，并在接触30分钟内记录击倒或死亡情况。此外，还平行地测定了一个参考阿拉伯按蚊的敏感品系（Dongola或Sekoru）。生物测定在每天15:00和17:00之间进行，以避免与昼夜节律有关的 RNA转录物表达的任何偏差。每种杀虫剂都有多个重复，以获得足够的用于RNA测序分析 的表型材料。在生物测定中，如果试虫能够以协调的方式站立和飞行，则被定义为“存活”；存活的蚊子即存在抗性，和未接触原液的蚊子（来自丙酮处理的瓶子）分别储存在-80℃。此外，未接触饥饿处理、羽化3天来自Sekoru和Dongola雌性敏感品系成虫，也保存至-80℃为后续分析工作存样。

使用Fi代田间蚊群暴露在1,2,5和10次诊断剂量下，进行额外的抗性强度生物测定，以确定对氨基甲酸酯类（苯迪卡和丙氧呋）和拟除虫菊酯类（alpha;-氯氰菊酯、溴氰菊酯和氯菊酯）的敏感性水平。世界卫生组织的生物测定数据标准所示：98%或更高的死亡率表明易感性，90 - 97%的死亡率表明存在耐药性，而低于90%的死亡率表明存在抗药性（世界卫生组织，2013）。在所有的抗性强度生物测定中，未处理的对照组的死亡率都低于5%。试蚊的平均死亡率是通过所有重复样本在给定杀虫剂击倒下数据计算岀来的。

2.3分子物种鉴定

在采集标本提取RNA之前，从每只生物测定中试蚊虫体中取下4 - 6条足，用Extractatrade; DNA Prep for PCR-组织试剂盒（QuantaBio, USA）提取基因组DNA，根据产品制造商设定 的程序进行。冈比亚按蚊的分子鉴定是用冈比亚按蚊、阿拉伯按蚊和四环按蚊的引物进行的 物种特异性 PCR （Wilkins 等，2006）。AR-3T （5rsquo;-GTGTTAAGTGTCCTTCTCCGTC-3rsquo;，阿拉伯按蚊的特异性引物），GA-3T（5rsquo;-GCTTACTGGTTTGGTCGG- CATGT-3rsquo;；冈比亚按蚊的特异性引物），QD-3T（5rsquo;-GCATGTCCAC- CAACGTAAATCC-3rsquo;；四环按蚊的特异性引物）和IMP-UN（5rsquo;- GCGAGTTGTAGATGCG-3rsquo;；所有物种的通用引物）。每个25个的反应体系包含 20-40 ng 的 DNA, 5X Green GoTaqreg; 反应缓冲液（Promega）, 25 mM MgCh, 2mM dNTP, 1U GoTaqreg; DNA 聚合酶和 25pmol/L 的引物 AR-3T、GA-3T、QD-3T 和 IMP-UN。 PCR循环的条件为：95℃ 5分钟，30个循环扩增（95C 30s, 58℃ 30s, 72℃ 30s）,最后在72℃延伸5分钟。扩增的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上可视化，用GelRedtrade;（Biotium，美国）染色。所有反应中都包括来自阿拉伯按蚊Sekoru、冈比亚按蚊Kisumu和四环按蚊Sangwe品系的阳性对照DNA和无模板阴性对照。PCR产物长度为387bp、463bp或636bp的片段，分别与阿拉伯按蚊、冈比亚按蚊或四环按蚊相对应。

2.4靶点突变检测

G119S Ace-1突变的存在是通过PCR限制性片段长度多态性所分析得到（Weill, et al, 2004）。扩增在25个的反应体系中进行的，反应中含有20 - 40ng的DNA, 5X Green GoTaqreg; 反应缓冲液（Promega），2.5 mM dNTP，1U GoTaqreg; DNA 聚合酶，25pmol/L 的引物 MOUSTDIR （ 5rsquo;-CCGGGNGCSACYATGTGGAA-3rsquo;）和 MOUSTREV1 （ 5rsquo;- acgatmacgttctcytccga - 3rsquo;）。PCR 循环条件为 95℃ 5

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