BTB和TAZ结构域支架蛋白在拟南芥的发育过程中起着至关重要的作用外文翻译资料

 2023-03-28 14:58:29

BTB和TAZ结构域支架蛋白在拟南芥的发育过程中起着至关重要的作用

Heacute;le`ne S.Robertdagger;, Ab Quint, Daan Brand, Adam Vivian - Smith and Remko Offringa*

荷兰莱顿大学生物研究所分子与发育遗传学系，瓦森纳苏韦格64,2333 AL莱顿

摘要：在拟南芥中，bric-a-brac、tramtrack和broad (BTB)结构域的支架蛋白组成了一个包含80个蛋白的家族，参与各种信号通路。BTB和TAZ结构域蛋白(BT1-BT5)亚家族的5个成员具有典型的结构域结构，仅在陆生植物中才能观察到。在此，我们对BT家族进行了功能分析，其中至少有4个成员是由生长素应答基因编码的。BT1是一种寿命较短的蛋白质，是26S蛋白酶体降解的特征性目标。表达模式、基因结构和序列分析表明，BT1和BT2具有密切的相关性。它们都定位于细胞核和胞质，而剩余的BT蛋白被确定为胞质蛋白。详细的分子和表型分析表明，BT家族成员之间存在大量冗余，并强调BT蛋白在雄性和雌性配子体发育中发挥关键作用。BT2似乎是这一过程中的优势基因，它通过相互转录调控被BT3和BT1功能取代。当其他BT成员丢失时，补偿性表达改变了剩余BT家族成员的稳态mRNA水平，这有助于功能冗余。我们的数据提供了一个令人惊讶的例子，表明配子体发育过程中需要的基因之间存在功能冗余，而目前的配子体突变筛检无法检测到这一点。

关键词：配子体发育； 功能冗余； 转录相互调控；蛋白-蛋白相互作用域；生长素应答；26S蛋白酶体。

介绍

在基本的细胞过程中，效应蛋白通常作为蛋白质复合物的一部分，由一个或多个支架蛋白或连接蛋白结合在一起。支架蛋白的重要性长期以来一直被低估，但功能缺失的发现导致了致命性，例如靶向蛋白水解诱导的CULLIN1和CULLIN3 (CUL3) (Hellmann et al.，2003;Gingerich等人，2005)，揭示了它们潜在的重要性，并恢复了对脚手架过程的兴趣。

支架蛋白以其蛋白-蛋白相互作用的结构域为特征，这些结构域是保守的，是支架蛋白分类的基础。支架蛋白的最大家族之一是由所谓的bric-a-brac、tramtrack和broad (BTB)结构域蛋白组成。保守的BTB结构域首先在果蝇黑腹果蝇蛋白中被发现，这些蛋白是转录调节蛋白BTB蛋白复合物的核心成分。

它也被称为POZ结构域，因为它出现在许多痘病毒锌指蛋白中(Albagli et al.，1995)。目前，BTB蛋白已在许多其他真核生物中被鉴定出来，包括酵母、秀丽隐杆线虫、哺乳动物和植物(Bardwell和Treisman, 1994;Stogios等人，2005)。

模型植物拟南芥和水稻的基因组分别编码10个亚家族中的80和149个BTB蛋白(Gingerich et al.，2005, 2007)，其中只有少数被详细研究过。大多数(但不是全部)拟南芥BTB蛋白将BTB结构域与至少一个其他蛋白-蛋白相互作用结构域结合，这些结构域似乎赋予这些蛋白特定的细胞功能。例如，在其他BTB蛋白中发现的锚蛋白和犰狳结构域参与了转录调控(Cao等人，1997;哈等人，2004年;Hepworth等人，2005;而含有MATH和TPR结构域的BTB蛋白BTB/POZ-MATH、乙烯OVER- PRODUCER 1 (ETO1)和et1样蛋白EOL1和EOL2分别与CUL3形成E3泛素蛋白连接酶复合物，CUL3将蛋白质标记为26S蛋白酶体降解(Wang et al.，2004;Dieterle等人，2005;Gingerich等人，2005;Weber等人，2005)。其他植物BTB蛋白参与多种细胞过程，如NPH3的向光响应(Motchoulski和Liscum, 1999)，叶片- on -叶柄1和2的叶片和花朵形态发生(Ha et al.，2004;Hepworth等人，2005;Norberg等人，2005)，以及乙烯对ETO1、EOL1和EOL2的响应(Wang等人，2004)。

我们发现BTB和TAZ域(BT)蛋白是蛋白激酶PINOID的相互作用伙伴(HR, MKZ, RB和RO，未发表的数据)。拟南芥基因组编码一个由5个BT蛋白组成的小亚家族，包括一个n端BTB结构域、一个转录适配锌指(TAZ)结构域和一个c端钙调蛋白结合(CaMB)结构域。此前，BT蛋白被发现以钙依赖的方式与马铃薯钙调蛋白6相互作用，而BT1、2和4被发现与溴域转录调节因子结合(Du和Poovaiah, 2004)。此外，BT2似乎是增强对外源生长素特定反应的反馈回路的一部分(Ren et al.，2007)。除此之外，人们对BT蛋白在植物发育中的作用知之甚少。本文对拟南芥中BT家族的功能进行了分析。我们发现，家族成员之间存在功能冗余，当其他BT基因发生无效突变时，特定BT基因的表达会上调或下调。BT蛋白要么是核质的，要么是细胞质的，要么只是细胞质的。值得注意的是，在不同的BT基因中含有多个空突变的植物表明BT蛋白在配子发生中发挥着重要作用，可能在整个植物发育过程中都发挥着重要作用。

结果——BT蛋白具有陆地植物特异性

将拟南芥BT家族的5个成员根据编码蛋白的氨基酸序列进行比较，可以区分出两组:第一组由BT1和BT2组成，第二组由BT3、BT4和BT5组成(图1a) (Du and Poovaiah, 2004)。这反映在预测的核定位信号(NLSs)和富含亮氨酸的核输出信号(NESs)中(La Cour et al.，2004)(图1b)，它们存在于BT1和BT2中，但不存在于BT3、BT4和BT5中，部分存在于外显子/内含子基因结构中。除拟南芥外，BT蛋白在水稻(Gingerich et al.，2007)、茄科(Solanaceae, SOL基因组网络，http://www.sgn.cornell.edu)、紫花苜蓿(Medicago)、红三叶草(red clover)和小立碗藓(Physcomitrella)中均有发现，但在藻类、酵母、真菌或动物中均无发现(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genomes)，这表明BT家族的域结构仅限于陆生植物(图1a)。

为了研究这些蛋白在拟南芥中的可能功能，我们从现有的材料中获得了相应基因中含有T-DNA或转座子插入的细胞系。在每一个案例中，被破坏的基因的零突变状态被证实(图1b-g)。所有的纯合插入突变体与野生型无明显区别。这些结果表明，拟南芥BT家族成员具有非必需的功能，或者存在功能冗余。

BT蛋白的亚细胞定位

先前对BT1亚细胞定位的分析表明，该蛋白主要是核蛋白(Du和Poovaiah, 2004)。事实上，用35S::BT1:YFP转染拟南芥原质体后发现，在62%的原生质体中，BT1:YFP既是核的又是胞质的(n = 34，图2b)，而在38%的原生质体中，BT1:YFP是胞质的(n = 21，图2a)。当BT2的c端YFP融合在原生质体中表达时，90% (n = 31)的细胞显示胞质定位(图2c)，10%的细胞同时显示核和胞质定位(图2d)。越少的核本地化BT2相比BT1是同意的比例预测nls和湖水,3:1 BT1而言,和2:2的BT2(图1 b),从而表明这些假定的nls和洛克BT1和BT2功能。BT4:YFP和BT5:YFP仅存在于细胞质中(n = 40和33;图2e-f)，对应于BT4和BT5中没有预测NLSs的事实。Western blot分析证实，原质体表达的BT:YFP融合蛋白为全长(图2h)。

BT1是拟南芥中一种寿命较短的蛋白质

为了确认BT蛋白在植物中的亚细胞定位，并进一步分析其功能，我们使用35S::BT1:GFP和35S::GFP:BT1构建了稳定的转化子，或者构建了包含BT1的BTB结构域与GFP的c端融合的结构体(35S::BTB:GFP)。对于每个结构，至少有25个独立的T2 线的生成和研究。每个品系显示一个野生型表型。35S::BT1:GFP和35S::BTB:GFP都没有显示出明显的细胞质荧光信号，只有少数35S::GFP:BT1细胞质荧光信号与可溶性GFP相似(图2j)。

(一)

(c)

(d)

(e)

(b)

(f)

(g)

图1，拟南芥BT家族

(a)基于CLUSTALW蛋白比对的树图，显示拟南芥、水稻、苜蓿和三叶草BT蛋白之间的关

系。该树是使用邻居连接方法构造的，并通过一次引导测试进行了10,000次迭代。

(b)拟南芥5个BT基因的结构。黑盒子代表外显子。在编码n端BTB域、TAZ域和Cterminal CaMBD域的部分加下划线。预测的核定位信号(NLSs)和核输出信号(NESs)分别用圆形和正方形表示。对于BT1，在位置aa57-60、aa193-203、aa342-345和aa181-183分别有3个NLSs和1个NES。对于BT2，在aa65-81、aa203-212和aa191-197、aa294-302位置分别有两个NLSs和两个NESs。黑色箭头表示T-DNA或转座子插入位置，bt1-4 (GT2847)、bt2-3 (SALK_084471)、bt3-1 (Flag_396E01)、bt4-1 (SALK_045370)和bt5-1 (GABI-Kat 771C08)相对于ATG的位置分别为 748 bp、-173 bp、 357 bp、 430 bp和-42 bp。

(c - g)通过northern blot (c, d)和RT-PCR (e - g)分析bt1-4 (c)、bt2-3 (d)、bt3-1 (e)、bt4-1 (f)和bt5-1 (g) 8日龄的bt突变体的空等位基因状态。RT-PCR的阳性对照是Col-0或Ws cDNA和基因组DNA (gDNA)。阴性对照为RT酶省略(Col -RT)和水(H2O)反应。rRNA、a-微管蛋白和ROC表达作为加载对照。注意，对于bt4-1样品(f;星号)，基因组DNA污染存在，cDNA缺失。

进一步的分析表明，在这些GFP阳性品系中没有检测到全长融合蛋白，即使在体内产生了全长GFP:BT1 mRNA(图2k -l)。上述结果，加上携带c端融合的所有品系均缺乏荧光信号(图2m)，提示BT1和BT1:GFP融合不稳定。为了验证这一点，将表达BT1:GFP或BTB:GFP的幼苗用26S蛋白酶体抑制剂MG132 (50 lM)处理。处理4 h后，在不同细胞系的根细胞的细胞核和细胞质中均观察到荧光信号(图2n-p)。放大后，核定位不是均匀的，而是由亮点组成(图2p)。其他靶向26S蛋白酶体的蛋白质也有类似的观察结果(Hamann et al.，2002;陶等，2005)。Western blot分析证实了全长融合蛋白的存在，在mg132处理的样品中，融合蛋白的数量明显更多(图2q)。生长素或生长素转运抑制剂的不同处理并不影响MG132处理样品的稳定性，也不影响BT1:GFP或BTB:GFP融合蛋白的亚细胞定位。荧光显微镜观察除根外的组织，如叶子和花序，并没有识别出组织特异性的BT1:GFP或BTB:GFP融合蛋白的稳定性(数据未显示)。这些结果表明，BT1是一种寿命较短的核细胞质蛋白，通过26S蛋白酶体途径降解，并表明其蛋白酶体介导的降解与该蛋白n端含有BTB结构域的部分有关。

BT家族成员间的补偿表达

为了检测BT家族成员之间的基因冗余度，我们采用northern blot和定量RT-PCR (qPCR;图S1和S3a, c和d)。分析的四个拟南芥BT基因在野生型莲座叶中表达最丰富。BT1和BT5也在茎中表达，BT2和BT5在幼苗中表达显著，BT4和BT5在花和角果中表达最多。总的来说，这些数据与之前发表的northern和微阵列分析(图S2a和b)有很好的相关性(Du和Poovaiah, 2004;Zimmermann等人，2004年;Gingerichet。,2005)。此外，我们还发现，BT1、BT2和BT5在不同的稳态水平下表现出生长素(吲哚-3-乙酸，IAA)快速和短暂的诱导表达，在处理后30 min达到峰值。此时BT4的表达也增强了，但RNA水平一直增加到4小时，并且这种水平的增强至少持续到生长素处理后24小时(图3b)。

(一)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(我)

(j)

(k)

(左)

(问)

(m)

(n)

(o)

(p)

图2，拟南芥BT蛋白的亚细胞定位。

(a - g) 拟南芥原生质体表达c端YFP:HA融合BT1 (a, b)、BT2 (c, d)、BT4 (e)和BT5 (f)或单独表达YFP:HA (g)的荧光共聚焦图像(左)和相应的透射光图像(右)。对于BT1:YFP和BT2:YFP，显示细胞质(a, c)或细胞质和核同时定位(b, d)的细胞百分比。

(h)抗ha细胞提取物的Western blot分析证实(a-f)中表达了全长BT:YFP融合蛋白。

(i, j) 35S::GFP:BT1-15 (i)和35S::GFP (j)根表皮细胞的共聚焦图像显示相同的胞质和核定位的GFP信号。

(k) 用BT1(上)或GFP探针(下)Northern blot分析表明，35S::GFP:BT1细胞株14和15均能产

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