热处理对不同脱脂浓度脱脂牛奶培养乳酸菌存活的影响外文翻译资料

 2022-08-08 12:00:55

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热处理对不同脱脂浓度脱脂牛奶培养乳酸菌存活的影响

摘要：将4株乳酸菌（乳酸菌）在不同固体含量的脱脂复原乳中培养，比较其耐热性。当牛奶浓度从5%增加到30%时，非乳糖发酵菌株的数量在稳定生长期增加了1 log左右。当用乳糖发酵菌株发酵时，高固形物乳保持相对稳定的pH值（Delta;pHlt;0.5），而低固形物乳的pH值急剧下降1.35。在20或30 wt%的牛奶中培养的所有四个菌株在65℃热处理10分钟后，在细胞存活率（剩余活力gt;108 CFU/mL）和生长能力方面均表现出显著的改善，表明无论代谢途径如何，都具有一般的热保护作用。除了在细菌生长过程中细胞对高渗压的反应外，我们提出增加乳制品保护成分的浓度、增加培养基的粘度和耐热性也有助于提高细菌的耐热性。

1.介绍

许多乳酸菌（乳酸菌）菌株在体外和体内条件下显示出益生菌效应（FAO/WHO，2001）。例如，干酪乳杆菌Zhang对高脂血症大鼠具有抗氧化作用，并且可以影响人类的肠道微生物群（Kwok et al.，2014；Zhang et al.，2010）。鼠李糖乳杆菌GG对某些肠道病原体具有抗菌活性（De Keersmaecker et al.，2006；Hudault et al.，1997）。植物乳杆菌P8可以缓解压力成人的焦虑（Lew等人，2018）。干酪乳杆菌BL23具有免疫调节特性，可减轻结肠炎（Bauerl et al.，2010；Watterlot et al.，2010）。这些菌株作为药物和功能性食品已引起广泛关注。当益生菌产品中的活菌数量超过要求值时，施用微生物后对宿主的有益作用发生。按照国际乳品联合会的建议，食用时，每克或每毫升产品的细菌最少计数应大于CFU，而目前的趋势通常要求每份食物的总剂量大于CFU（Balthazar等人，2017年；Corona Hernandez等人，2013年；Fenster等人，2019年）。因此，建立大规模的益生菌产品生产是至关重要的，这些益生菌产品含有足够水平的具有良好保留功能的活细胞。在这些产品中，细菌的应激耐受性是决定其在加工、储存和人体消化过程中适应具有挑战性的环境能力的关键因素（Hussain et al.，2013；Zhao et al.，2019）。在食品加工过程中对乳酸菌细胞施加的各种应力中，细胞承受热压力的能力往往是一个关键的标准，这可以归结为两个方面。首先，在食品加工过程中经常会遇到加热，例如喷雾干燥过程中，液体培养物转化为粉末状以延长其保质期（Fu和Chen，2011；Schutyser等人，2012）。第二，耐热性增强的乳酸菌细胞通常对氧化应激和胆盐等其他应激表现出交叉适应效应（Desmond et al.，2001；Dijkstra et al.，2014）。

乳酸菌的内在应激耐受性受所用培养条件的显著影响，包括培养基的组成、温度、pH值和氧化条件（Dijkstra等人，2014；Gaucher等人，2020）。为了提高乳酸菌对环境压力的稳健性，文献中对培养基进行了多种改良。在早期的研究中，乳酸菌无法发酵的成分，如NaCl和蔗糖，被添加到培养基中，以诱导细胞适应渗透压，但脱水后细胞存活率的改善相对不显著（Ferreira et al.，2005；Kets et al.，1996；Linders et al.，1997；Silva et al.，2004）。最近的一项研究表明，向乳酸菌的生长培养基中添加Ca2 可以提高细胞的耐热性以及喷雾干燥后的存活率（Wang et al.，2020）。据报道，通过在细胞培养过程中添加乳糖和NaCl对丙酸杆菌freudenreichii也有类似的效果（Gaucher等人，2020）。Huang等人（2016a）利用浓缩的甜乳清作为2合1培养基来生长和喷雾干燥干酪乳杆菌BL23和丙酸杆菌freudenreichii ITG P20，结果表明，随着甜乳清总固形物质量分数由5%增加到20%或30%，喷雾干燥后的菌群和残留活力均增加。在高浓度培养基中培养的细胞显示出对热、酸和胆盐压力的显著改善的稳定性，这归因于关键应激蛋白的过度表达和相容溶质的累积（Huang等人，2016b）。鉴于甜乳清是凝乳酶型干酪生产过程中的副产品，其作为发酵底物的可用性可能受到限制。一种成本低、用途广泛的替代性底物将是大规模生产益生菌产品的一大优势。

复原脱脂奶是最著名的乳酸菌细胞保护剂之一（Fu和Chen，2011）。先前的研究表明，许多脱脂乳成分，如乳清蛋白、钙和乳糖，在喷雾干燥、储存和消化过程中，能够在不利条件下保护益生菌细胞的活性（Huang和Chen，2013；Mattila Sandholm等人，2002；Rajam等人，2012；Su等人，2019；Wang等人，2016）。虽然10%质量分数的复原脱脂奶是培养乳酸菌和检测其发酵活性的常用发酵基质，但增加脱脂复原乳的浓度可能是一种可行的方法，以获得具有增强耐受性的乳酸菌细胞。

本研究的目的是探讨乳酸菌细胞在不同固体含量的RSM培养基中的耐热性。以标准培养基（5.0%肉汤培养基）为对照，在复原脱脂乳为5.0～35.0wt%范围内培养了4株益生菌，即干酪乳杆菌（LCZ）、鼠李糖乳杆菌GG（LGG）、植物乳杆菌P8（LP）和干酪乳杆菌BL23（LCBL23）。首先研究了每种牛奶的流变行为和乳酸菌生长，然后用65℃和70℃的热处理评价细胞的耐热性。讨论了乳酸菌在高固体分RSM中生长的耐热性增强的可能机制。

2.材料和方法

2.1. 微生物

干酪乳杆菌张（LCZ）和植物乳杆菌P8（LP）由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程重点乳酸菌慷慨提供。鼠李糖乳杆菌GG（LGG）是从一种商业产品（Culturellereg;，美国康涅狄格州纽黑文）中获得的。干酪乳杆菌BL23由UMR1219 Michalis（INRA AgroParisTech，Jouy En Josas，法国）提供。所有培养物保存在MRS琼脂平板上，并储存在4℃下，每7天传代至新鲜培养基。通过将琼脂平板上的单个菌落转移到10ml MRS肉汤中制备每个菌株的接种物，然后在37℃下培养12h。

2.2．材料和介质准备

MRS粉购自Oxoid（英国汉普郡）。琼脂粉和蛋白胨购自Solarbio（中国北京）。脱脂奶粉在当地购买（Devondalereg;，澳大利亚）。根据产品说明书，每100克固体奶粉的成分为35克蛋白质、1克脂肪、53克碳水化合物、0.45克钠和1.15克钙。所有介质和溶液均用Milli-Q水（Milli-Qreg;Direct 16，德国达姆施塔特默克密理博公司）制备。

将琼脂粉末添加到浓度为11.0 g/L的重组MRS肉汤中，制备MRS琼脂平板。所有MRS肉汤、MRS琼脂和玻璃器皿在121℃下灭菌15分钟。将脱脂奶粉溶解在Milli-Q水中，制备RSM培养基，使总固形物含量达到5.0、10.0、20.0、25.0、30.0、35.0和40.0 wt%。将得到的牛奶样品在105℃高压灭菌10分钟（Fu等人，2013），然后在接种乳酸菌接种物之前冷却至室温（约20℃）。

2.3. RSM流变性能的测定

采用配有平行板（Phi;40mm，间隙=0.154mm）的旋转流变仪（Kinexus pro ，Malvern，UK）测定了不同固体含量的RSM介质的流变性能。在25℃下对未经高压灭菌的新制备的RSM进行测量。通过记录剪切速率从0.1增加到100时的剪切压力，确定每个RSM介质的流动特性。=

2.4. 不同固形物含量RSM培养基中乳酸菌的培养

以5.0wt%MRS肉汤为对照，用每个乳酸菌菌株的12h接种液接种到1%（v/v）的高压灭菌的RSM培养基。这四个菌株分别在37℃的固定培养箱中培养。通过每6或12小时取样并用标准平板计数法分析活细胞计数（Zheng等人，2015）监测LCZ和LGG在不同培养基中的生长曲线，直至培养96小时。

对于热处理实验，乳酸菌培养物在RSM培养基中培养36小时，在MRS肉汤中培养24小时。根据测量的生长曲线，选择培养时间作为每个菌株达到稳定生长阶段的时间。在通过涡旋（Poxiwar，中国）将每种培养物彻底混合后，用pH计（Orion Star A211，Thermo Scientific，US）测定固定相乳酸菌培养物的pH值。

2.5. 乳酸菌培养物的热处理

2.5.1. 热处理

在RSM培养基中培养36小时和在MRS肉汤中培养24小时后，对乳酸菌培养物进行热处理。涡旋后，将每种培养物5ml转移到50ml离心管中。为每种培养物制备两个试管。其中一根试管作为未加热的样品，另一根试管放入热混合器（Eppendorf，德国）中预热至65℃或70℃。根据初步实验结果，热处理时间控制为10分钟。10分钟后立即取出样品管，放置在冰浴中1分钟，然后进行进一步分析。在热处理过程中，乳酸菌培养物的温度变化通过插入50ml离心管盖的微型热电偶进行监测。在测试的加热方案下，每种培养物都经历了温度升高（图1），以模拟喷雾干燥期间雾化液滴的温度分布（Huang et al.，2014；Rogers et al.，2012）。

图1 在65℃热处理期间，在具有不同固体含量（wt%）的复原脱脂乳（RSM）中生长的LCZ培养物的温度曲线。每个培养物的体积为5 mL，置于50 mL离心管中。每条曲线代表重复测量的平均结果。

2.5.2. 乳酸菌热处理后存活和生长能力分析

热处理10min后，在MRS琼脂上用平板计数法测定每个样品的活细胞数。细菌的存活率用N/N0表示，其中N是热处理后的剩余菌群，N0代表未处理样品中的菌群。

还监测了热处理对乳酸菌细胞生长能力的损害（Su等人，2019年）。将加热和未加热的培养物接种到48孔微孔板中的1ml新鲜MRS肉汤中，接种量为1%（v/v）。将微孔板在37℃下培养48小时，并使用微孔板读取器（SpectraMax M5，Molecular Devices，CA，USA）以600 nm每间隔20分钟读取每个接种孔的光密度。

2.6. 统计分析

所有培养和热处理实验至少独立进行三次。活细胞计数、存活率和pH值均为平均值plusmn;标准差。采用单因素方差分析和事后Tukey检验（Origin，Origin乳酸菌）分析平均值之间的显著性差异（plt;0.05）。生长能力实验分两次进行，报告的生长曲线代表平均结果。

3.结果与讨论

3.1. 不同固形物含量的RSM的流变性能

图2显示了新制备的RSM的流量曲线。固形物含量le;20wt%的介质的剪切应力与剪切速率呈近似线性关系，可以认为是牛顿流体。在相同的剪切速率下，增加牛奶的总固形物显著增加剪切应力，对应于较高的介质粘度。对于40 wt%RSM，100处的最大剪切压力为3.19 Pa，几乎是30 wt%RSM的3倍。与固体含量较低的培养基相比，固体含量为30%和40%的RSM之间的差距较大，表明牛奶粘度的增加与固体含量的增加不成正比。固体质量分数为30%和40%的RSM表现出剪切变稀行为，这是对固体含量相对较高的牛奶蛋白溶液的常见观察（Kieferle et al.，2019）。在105℃高压灭菌10分钟后，固体含量le;35 wt%的RSM可以保持流动，但40 wt%的牛奶表现出凝胶状特性，这可能是加热期间强烈的美拉德反应和蛋白质-蛋白质相互作用的结果（Kieferle et al.，2019）。半固态发酵过程中细菌细胞的生长可能与液体深层发酵过程不同。此外，对于许多工业操作，如喷雾干燥，液态进料比半固态进料更容易加工和转移。因此，本研究中不使用40 wt%和更高固体含量的RSM培养乳酸菌细胞。

图2不同固形物含量（wt%）的新鲜复原脱脂乳（RSM）的流动曲线。（a） 压力范围在0至3.5 Pa之间；（b）压力范围在0至0.8 Pa之间。

    1. 乳酸菌在不同固形物含量的RSM培养基上的生长

用LCZ和LGG研究了RSM浓度对LAB生长的影响（图3）。与在MRS肉汤培养基中培养的相比，在RSM培养基中培养的乳酸菌在达到稳定生长期方面有延迟，并且稳定生长期的持续时间延长。以LCZ为例，在肉汤培养基上培养24h后活细胞数可达cfu/mL左右，然后在大约24小时内趋于平稳，随后是在接下来的48小时内迅速下降超过两个数量级。与之相反的是，LCZ在各种乳培养基中的活细胞数都能保持在峰值附近，直到培养96h后才略有下降。稳定生长期的活细胞数随着RSM固形物含量的增加而增加。在5wt%的牛奶中培养的LCZ在培养24~96h时，活细胞浓度约为，然而当采用25和30wt%的RSM培养基时，细菌总数显著增加至。LGG培养物在稳定期的延迟发生和较高乳汁浓度下细胞群的增加方面显示出类似的趋势（图3b）。LCZ和LGZ都是非乳糖发酵菌株。由于不能直接利用乳糖（RSM中的主要碳水化合物）作为碳源，在低固体分RSM中培养的细胞生长缓慢，活细胞数低。细菌的生长可能依赖于牛奶蛋白质作为碳源和氮源；同时，牛奶中的其他能源也可能得到利用，如葡萄糖、柠檬酸盐、脂肪酸等（Williams et al.，2000）。在高固形物RSM培养基中，丰富的养分有利于LCZ和LGG的数量增长。

图3 在不同固形物含量（wt%）的重组脱脂乳（RSM）中培养的（a）LCZ和（b）LGG的生长曲线与在标准培养基（MRS）中培养的比较。

在RSM培养基中，乳酸菌的稳定期的延长可能与培养基的营养缺乏和低酸度有关。肉汤培养基中的主要碳源是葡萄糖，葡萄糖易于被细菌吸收和利用（De Man et al.，1960

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