干腌宣威火腿抗氧化肽的纯化与鉴定外文翻译资料

 2022-08-04 20:55:31

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干腌宣威火腿抗氧化肽的纯化与鉴定

卢娟星、胡雅雅、胡红艳、葛青峰、周广红、张万刚

南京农业大学食品安全与营养协同创新中心食品科学与技术学院教育部肉类加工与质量控制实验室，江苏南京210095

摘要

本研究主要对宣威火腿干腌过程中产生的抗氧化肽进行了纯化和鉴定。以对自由基和亚铁离子的清除作用为基础，研究了宣威火腿粗肽的抗氧化活性。从对1,1-二苯基-2-苦味酸（DPPH）、羟自由基（.OH）和超氧阴离子（O2-.）的清除作用来看，成熟期产生的XHP具有较强的抗氧化活性。采用尺寸排阻色谱法、阴离子交换柱和反相高效液相色谱法，根据分子量和极性差异，分离出具有较强抗氧化活性的组分。结果表明，宣威火腿在长期加工过程中产生了抗氧化肽，其中四肽Asp-Leu-Glu可能是抗氧化活性的关键肽之一。

1介绍

在生物活性肽的研究中，已经研究了不同的功能效应，如降压、抗氧化、抗癌、抗菌、阿片活性、矿物结合、免疫调节、降胆固醇和抗糖尿病（Fitzgerald et al.，2012；Liamp;amp;Aluko，2010）。生物活性肽直接从植物、动物、微生物、真菌中提取，或间接从这些原料的水解物中提取（Samaranayakaamp;amp;Li Chan，2011）。宣威火腿是中国传统的肉制品，从干腌技术产生到保存生肉已有1000多年的历史（(Qiao amp; Ma, 2006）。宣威火腿产于云南省宣威市，全境平均气温在13℃～14℃之间，加之山区特殊的气候条件，为火腿的自然成熟提供了优越的环境。在成熟期，大分子蛋白质和脂肪被内切酶水解，产生小肽和脂肪酸，形成宣威火腿独特的风味和潜在的有益健康作用（Xiao et al.，2009）。小分子肽可以穿过消化上皮屏障进入血管，并被一种特殊的转运系统吸收，这种转运系统不同于氨基酸载体系统（Humphreyamp;amp;Ringrose，1986）。

人们逐渐接受，体内氧化应激与许多人类疾病密切相关，包括炎症、动脉粥样硬化、缺血、癌症和衰老（Mittler，2002）。一旦自由基不能被广泛清除，它们可能会通过一系列的分子损伤而导致对人体有害的氧化应激。因此，膳食抗氧化剂被广泛应用于保护生物分子免受自由基的破坏。合成抗氧化剂（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）、丁酸羟基苯甲醚（BHA）和没食子酸丙酯（PG）具有较强的抗氧化活性，在食品体系中得到了广泛应用。然而，这些合成抗氧化剂被报道通过干扰生物体内的酶活性而产生负面影响（Conningamp;amp;Phillips，1986）。因此，从香料、草药（Hinneburg, Damien, amp; Hiltunen, 2006）、大豆（Chen, Muramoto, Yamauchi, amp; Kiyoshi, 1996）和茶叶（Cao, Sofic, amp; Prior, 1996）中提取的黄酮、槲皮素、异黄酮、表儿茶素和倍半醇等天然抗氧化剂得到了广泛的研究，这些抗氧化剂通常被认为是安全无毒的。近年来，从植物或动物产品中提取的肽被证明具有抗氧化活性，可替代食品系统中的合成抗氧化剂（Samaranayakaamp;amp;LiChan，2011；Sun，He，Xie，2004）。 Qian, Jung, and Kim (2008)报告，牛蛙皮水解液经大小排斥层析纯化后，对自由基（1,1-二苯基-2-苦肼、过氧基、超氧和羟基）的清除率高60%。最近的一项研究表明，从中国传统金华火腿中提取的肽具有清除自由基的能力，最活跃肽的序列被确定为Gly Lys-pheasn-Val(Zhu et al., 2013)。大多数来自食物来源的抗氧化肽由2-16个氨基酸组成，分子量在500-3000达之间(Samaranayaka amp; Li-Chan, 2011)。然而，除了口感或风味特征外，目前还没有对我国干腌宣威火腿中产生的抗氧化肽进行研究。因此，本研究旨在纯化具有高抗氧化活性的肽，并确定主要肽序列，以探讨玄味火腿的抗氧化能力。

2材料和方法

2.1. 材料

宣威火腿购自普济食品公司(Xuanwei, Yunan, China)。1,1-二苯基-2-吡啶酰肼（DPPH）和谷胱甘肽（GSH）购自Sigma Chemical Co.（MO，USA）。氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢（NADH）和硫酸非那锌（PMS）购自中国上海国药化学试剂有限公司。乙腈和甲酸为高效液相色谱级，总抗氧化能力试剂盒（T-AOC）和其他试剂为分析级，从南京建成化学试剂有限公司(Nanjing, China)购买。Asp-Leu-Glu（98%纯度）由中国肽公司(Suzhou, China）合成。

2.2. 宣威干腌火腿

宣威火腿是在自然成熟6-8个月后从食品公司购买的。火腿在冷藏室（2-4℃，相对湿度58-72%）腌制2个月。在此期间，用不同含盐量（第一次1.5%，第二次2.5%，第三次1.5%）腌制三次火腿。随机抽取6只火腿。用手切火腿脂肪和肌腱，用股二头肌提取肽。

2.3. 肽提取

根据f Escudero, Mora, Fraser, Aristoy, and Toldraacute; (2013)的研究，将来自加工的宣威火腿的20 g股二头肌切碎，并用均质器(IKA T25 digital ultraturrox, Germany)将80 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mmol/L，pH 7.2）均质三次（22000 rpm下各10 s）。然后将匀浆在4℃下离心（12000g）20 min。通过滤纸过滤，在上清液中加入三体积乙醇（40%，V:V）以结合蛋白质，并在4℃下保持120 min，然后离心（12000g，20 min，4℃）。在通过0.45 mu;m膜过滤器(Millipore, Bedford, MA, USA)过滤后，上清液在旋转蒸发器中干燥，然后在-20℃下储存直至使用。

2.4. 肽含量

采用Church, Swaisgood, and Porter (1983) 的方法测定宣威火腿中的多肽含量，并对其进行了改进。将160mg邻苯二甲醛（OPA）溶解于甲醇（4 mL）中，然后添加100 mL四硼酸钠（0.1 mol/L）、400 mu;Lbeta;-巯基乙醇和10 mL 20%（w/w）十二烷基磺酸钠。通过添加去离子水将体积调节至200mL。制备了供日常使用的OPA溶液。将浓度为1 mg/mL的200微升提取物（溶解于去离子水中）与4 mL OPA溶液混合，并在室温下无光培养2 min。用紫外分光光度计(UV-2450, Shimadzu, Japan)在340nm处测定混合物的吸光度，以酪蛋白为标准品，线性浓度。根据酪蛋白标准曲线，计算肽含量。

2.5. DPPH自由基清除活性

该方法是在Luo, Wang, Yu, Qu, and Su (2010)的研究基础上进行的修正。将1mL XHP（溶于去离子水）与1mL 0.2 mmol/L DPPH（溶于95%乙醇）混合作为样品组；将1mL去离子水与1mL乙醇（95%）混合作为空白组；将1mL 0.2 mmol/L DPPH与1mL乙醇（95%）混合作为对照组。使用旋涡搅拌混合物并在室温下避光培养30 min，然后测量517 nm处的吸光度。XHP和GSH的清除活性通过以下公式计算：

DPPH自由基清除活性（%）=[1-（A样品-A空白）/（A对照-A空白）]times;100

A样品A空白和A对照分别表示样品组、空白组和对照组的吸光度。

2.6.超氧阴离子自由基清除活性

这种方法遵循了Liu, Ooi, and Chang (1997)的研究，并做了一些修改。所有化学品和样品均溶于Tris–HCl（50 mmol/L，pH 8.0）。在NBT（0.5 mL，300 mu;mol/L）、NADH（0.3 mL，468 mu;mol/L）和PMS（0.5 mL，60 mu;mol/L）的混合物中产生超氧阴离子自由基。搅拌后，混合1.5 mL XHP，然后在25 C下保持5 min。与样品组相似，但将Tris–HCl（50 mmol/L，pH 8.0）代替XHP作为对照组。在560nm处测量混合物的吸光度，并以GSH作为对照。使用以下方程式测量清除活性：

超氧阴离子自由基清除活性（%）=[1-A样品/A对照]times;100

A样品，A对照分别表示样品组和对照组的吸光度。

2.7.Fe2 螯合活性

将1 mL XHP(溶于去离子水中)与0.05 mL二氯化铁(2 mmol/L)混合，并加入0.2 mL铁嗪(5 mmol/L)以激活反应。以去离子水代替XHP与其他试剂混合作为对照组，以谷胱甘肽作为阳性对照。溶液在室温下孵育10 min，测量562 nm的吸光度，得到Fe2 螯合能力，方程如下:

Fe2 螯合活性（%）=[（A对照-A样品）/A对照]times;100

A样品，A对照分别表示样品组和对照组的吸光度。

2.8.羟基自由基清除活性

对Jin, Cai, Lin, and Zhao (1996)报道的测定清除羟自由基活性的方法进行了改进。将300mu;L ，10-菲咯啉一水合物(5 mmol/L)与0.3 mLXHP(溶于去离子水中)、0.2 mLPBS (0.2mol/L，pH 7.4)、0.3 mL乙二胺四乙酸(15 mmol/L)和0.3 mL硫酸亚铁(5 mmol/L)混合。搅拌后，通过加入0.4 mLH2O2(0.01%)激活反应。以谷胱甘肽为对照，在37℃保持30 min。XHP被去离子水替换为损伤组。对于未受损组，用去离子水代替H2O2。扫气结果按下式计算:

羟基自由基清除活性（%）=（A治疗-A损伤）/（A未损伤-A损伤）times;100

A治疗A损伤和A未损伤分别代表治疗组、损伤组和未损伤组的吸光度。

2.9.G-25尺寸排阻色谱法

XHP用葡聚糖凝胶柱纯化(26times;10厘米)，Sephadex G-25(Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden作为填料，根据Ko, Kim, and Jeon (2012)的研究对纯化方法进行了改进。该柱用超纯水平衡。将2 mL XHP溶解在超纯水中，并以2 mL/min的流速和作为洗脱缓冲液的超纯水进行尺寸排阻色谱。样品在280nm的吸光度下检测，在室温下通过自动馏分收集器收集2 mL洗脱液。冻干后，分析每个级分的活性，并将干燥的级分储存在-20℃作进一步分析。

2.10.阴离子交换色谱

G-25分离的抗氧化肽通过蛋白液相色谱(AKTA)在HiPrep 16/10 DEAE阴离子交换柱(Uppsala, Sweden) 上按照Ngo, Qian, Ryu, Park, and Se (2010)的方法纯化。将肽溶于浓度为10 mg/mL的磷酸盐缓冲液中。HiPrep 16/10 DEAE离子交换柱用PBS平衡，以线性氯化钠梯度(0-100%)洗脱，流速为2 mL/min。在280 nm的吸光度下监测样品，收集2 mL洗脱液。冷冻干燥后，检测抗氧化活性，得到活性较强的组分。

2.11.高效液相色谱法

具有强抗氧化活性的级分通过反相高效液相色谱(Waters Inc., Milford, MA, USA)在BEH 130 C18上纯化(水，1.7 mu;m，2.1times;150 mm)柱。将肽溶于浓度为10 mg/mL的超纯水中，洗脱缓冲液含有洗脱液A (0.1%，甲酸)和洗脱液B (100%，乙腈)。按照以下方法进行线性梯度:1–5 min，100%A；5–20 min，30–80%B；20–25 min，100%A。流速设定为0.3 mL/min。在280 nm的紫外波长下监测样品，根据峰面积收集馏分，然后冷冻干燥。使用上述方法测量抗氧化活性。

2.12.液相色谱-串联质谱法分析肽序列

用Acquity高效液相色谱系统与反相BEH130 C18分析柱(1.7 mu;m，2.1times;150 mm)。线性梯度按以下方法进行:1–5 min，100%A(0.1%，甲酸)；5–20 min，30–80%B(100%，乙腈)；20–25 min，100%A(0.1%，甲酸)。流速设定为0.3 mL/min。流量直接进入质谱/质谱系统进行多反应测量。前体离子的记录质量范围是m/z 200–4000。用Mass Lynx V4.1操作仪器，分析质谱图信息。

2.13.统计分析

所有数据用SAS软件（9.0版）进行分析，单因素方差分析（ANOVA）采用Duncan多范围检验（20），差异有显著性（Plt;0.05）。

3.结果和讨论

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