利用水稻基因组鉴定方法定位除草剂二氯喹啉酸解毒基因外文翻译资料

 2022-08-05 16:26:12

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利用水稻基因组鉴定方法定位除草剂二氯喹啉酸解毒基因

综述：

二氯喹啉酸是一种高选择性的生长素生长素型除草剂，广泛用于稻田稗草的有效防治，为提高世界水稻产量做出了重要贡献。先前已有相关研究探明了二氯喹啉酸的除草作用模式，并确定了影响二氯喹啉酸信号传导的激素相互作用关系。由于过量的使用，可能导致其与水一起排出稻田，导致水土污染和其他环境健康问题。本研究利用57K Affymetrix水稻全基因组阵列鉴定二氯喹啉酸信号响应基因，研究二氯喹啉酸在水稻植物中的作用机理和解毒的分子机制。总的来说，实验探明了637个探针组，在二氯喹啉酸处理6小时或24小时的情况下，其表达水平都有所差异。GH3和OsIAAs等Auxin相关基因对二氯喹啉酸处理有显著反应。基因本体分析显示出，解毒相关家族基因的显著富集，包括细胞色素P450、GST、UGT以及ABC和药物转运基因。此外，实时RT-PCR分析显示，CYP81、CYP709C、CYP72A等P450家族的候选基因普遍被不同除草剂诱导。在二氯喹啉酸处理下，同一P450家族的部分拟南芥基因被表达上升。我们进行了水稻全基因组GeneChip分析，并首次在全球范围内鉴定了二氯喹啉酸响应基因。这项工作将为二氯喹啉酸和环境化学污染的生物单体的解毒提供参考。

关键词：大米，二氯喹啉酸，转录组，P450，基因本体

简介：

水稻(Oryza sativa)是一种重要的农作物，约占世界人口的一半的人将其作为主食。然而，一些杂草，如稗草（Echinochloa crusgalli）在田间的繁殖大大降低了世界水稻的平均产量。二氯喹啉酸（3,7-二氯-8-喹啉羧酸）是一种在一年生禾本科杂草和一些禾本科作物之间具有特定选择性的除草剂（Koo等人，1996年；Resgalla等人，2007年）。二氯喹啉酸是一种毒理学等级为III级(低毒)的喹啉类化合物，近年来，它被广泛用于水稻田除草中，以有效控制稗草(Resgalla等，2007)。二氯喹啉酸是一种高选择性的生长素生长素型除草剂，最初是由巴斯夫公司用3000多种合成的衍生物进行铅优化而产生的，1988年被引入水稻种植系统（Haden等人，1985年；Grossmann，2000b，2003年）。

先前已有许多研究都对喹氯酸的作用方式进行了研究，包括植物吸收、转移、代谢、生物化学和分子机制等。(Haden等，1985；Grossmann，2000a,b，2003)。例如，研究了假裂体(Galium spurium L.)生物型对二氯喹啉酸抗性的生理和生化基础，研究了辅助素信号转导途径和二氯喹啉酸作用机制(Van Eerd等，2005)。提出了二氯喹啉酸在草类中的选择性作用模式，在敏感草中，二氯喹啉酸在根部诱导ACC(1-氨基环丙烷-1-羧酸)合成酶的活性，然后，ACC被运输到嫩枝，在嫩枝中转化为ACC，转化为乙烯和氰化物，引起植物毒性，而在抗性草中，二氯喹啉酸不能诱导ACC合成酶(Grossmann，2000b)。ACC合成酶的刺激作为敏感草中负责除草生长抑制的目标过程，但氰化物(一种乙烯的副产物)的产生在生长抑制和对二氯喹啉酸的实际细胞死亡反应中更为重要(Grossmann，1996)，具有生理破坏性的浓度的氰化物在敏感草中的积累是导致生长抑制和组织坏死的主要植物毒性化合物。该模型还表明，乙烯进一步引起叶子向下弯曲，并通过增加质体中的9-顺式环氧胡萝卜素二氧酶将黄绿素裂解为ABA前体黄曲霉素来刺激脱落酸(ABA)的生物合成(Hansen和Grossmann，2000；Grossmann，2000a；Grossmann等人，2001；Raghavan等人，2006；Kraft等人，2007)。其他植物激素，如绞股蓝和细胞分裂素的浓度仅有轻微变化（Grossmann，2000年a）。

由于二氯喹啉酸的广泛使用，可能会导致与其水一起被排出稻田，最终导致水土污染和其他严重的环境安全问题。除草剂二氯喹啉酸不同于内源性恶性除草剂，具有长效性，因此对水稻灌溉区除草剂二氯喹啉酸残留进行风险分析非常重要。最近，对圣卡塔琳娜州（巴西）的7个水文流域进行的确定性和概率性风险分析表明--二氯喹啉酸是最常被检测到的农用化学品残留，在7个水文流域中的5个流域出现（Resgalla等人，2007年）。此外，在流经水稻生产灌溉区的河流中也检测到了二氯喹啉酸残留物。此外还有关于喹氯酸对动物和微生物的影响的研究。在水淹稻田土壤中加入不同浓度的喹氯酸对可培养微生物的潜在影响的相关研究。证明喹氯酸浓度是影响各种可培养微生物种群的关键因素的研究(Luuml;等人，2004a,b，2006；Chen等人，2005)。

此外，二氯喹啉酸还会引起银鲶鱼脑中酶活性增加，肌肉组织中酶活性受到抑制(Moraes等，2007)。因此，二氯喹啉酸解毒分析对农作物的除草剂耐受性和环境健康问题非常重要。酶活性分析表明，超氧化物歧化酶在防御二氯喹啉酸诱导的氧化应激方面至关重要(Lu等，2007)。喹氯酸的作用已经得到了广泛的研究和讨论，但基于分子的喹氯酸解毒分析仍然有限（Haden等人，1985；Grossmann和Kwiatkowski，2000；Grossmann，2000a，b，2003）。关于其他除草剂的抗药性和解毒机理的研究已经很成熟（Still和Kuzirian，1967年；Shimabukuro，1975年；Dixon等人，2003年；Hirose等人，2005年；Karavangeli等人，2005年；Labrou等人，2005年；Marcacci等人，2005年；Poienaru和Sarpe，2006年）。植物转录组图谱研究在揭示除草剂和杀虫剂抗性和激素信号转导途径的可能机制方面已被证实其可靠性(Hansen和Grossmann，2000；Zhong和Burns，2003；Armstrong等人，2004；Pasquer等人。2005；Andersson-Gunneraring;s等人，2006；Laskowski等人，2006；Nemhauser等人，2006；Kim等人，2007；Lee等人，2007；Manabe等人，2007；Shimono等人，2007；Zhang等人，2007a,b；Bruce等人，2008；Poupardin等人，2008；Vriezen等人，2008；Wenzel等人，2008）。) 例如，微阵列筛选发现苯并噻二唑(BTH)和水杨酸(SA)诱导的WRKY转录因子(TF)基因在BTH处理后3小时内上升。两个防御相关的基因，编码一个谷胱甘肽S-转移酶和一个细胞色素P450，受WRKY45调控(Laskowski等人，2006)。在酶系统中，谷胱甘肽S-转移酶和细胞色素P450一氧化酶是对增加除草剂代谢最负责的酶。使用类似的方法，发现顺式茉莉酮诱导的拟南芥基因影响了与蚜虫及其寄生虫的多体相互作用的化学生态，其中包括一种细胞色素P450（Poupardin等，2008）。最近，RNA-seq已被应用于表征稗草中对二氯喹啉酸的转录组(Li等人，2013a；Yang等人，2013)。

在本研究中，我们对二氯喹啉酸应答基因进行了水稻全基因组阵列筛查，并采用实时RT- PCR验证和生物信息学数据挖掘。主要目的有两个：首先是对水稻在二氯喹啉酸处理下的转录图谱进行概述，并对响应基因进行全局功能分类；更重要的是获得一些可能作为二氯喹啉酸解毒标记的候选基因，特别是P450和GST基因。

材料与方法：

植物材料和生长条件：

水稻 (Oryza sativa L.Nipponbare) 种子在5%次氯酸钠中表面灭菌20分钟，在蒸馏水中洗涤三次或四次，然后在温室中萌发 (28/25 ℃和12/12小时光照/黑暗循环，相对湿度83%) 。发芽后约3周，水稻植株在第二叶期，用不同的化学物质处理。

拟南芥 (Col-0) 种子表面灭菌。接种在MS -琼脂培养板上。然后在黑暗中在4°C下将种子分层3 d，然后转移到生长室(在22°C下16/8h光照/黑暗)。植物在MS培养基上再生长2周，然后用二氯喹啉酸处理。

化学处理与RNA分离：

化学处理和RNA分离所有纯除草剂都是从巴斯夫公司、路德维希沙芬（德国）处购得的喹氯酸、西格玛·奥尔德里奇公司获得的苯达松、Amersham公司处购得的氯马松[2-（2-氯苯基）甲基-4,4-二甲基-3-异恶唑酮]、阿文通制药公司处购得的甲基磺隆(法兰克福/M)和奥尔德里奇化学公司处购得的甲基维奥龙(百草枯。公司编号85617-7。这五种除草剂的化学结构如图4所示。

实验使用的试剂剂量和有关几个敏感性或抗性实验的参考资料（钱和马，2004年；阿卜杜拉等人，2006；彭等人，2008年)，向样本植物施用了以下浓度的化学品：喹氯酸1.65mM、苯达松19.98mM、甲磺隆1.31mM、氯马松1.75mM和氯马松10micro;M，所有试剂均以1%DMSO（二甲基亚砜）作为溶剂。植物样品经化学处理后，冷冻于液氮中，保存在80◦C下以便进一步分析。 对照样品(用1%DMSO处理)也同时用喹氯酸处理3、6和24h，拟南芥幼苗用喹氯酸处理6和12h，用其他化学物质处理6h。

使用Trizol(Invitrogen，CA，美国)提取总RNA。QiagenRNeasy试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化。Eppendorf生物测定仪测定RNA溶液的浓度和质量。

亲和力基因分析：

对每个样品，使用8micro;g的RNA制成生物素标记的cRNA靶点。所有cDNA和cRNA合成、cRNA片段化、杂交、洗涤和染色以及扫描的处理均遵循GeneChip标准方案（真核塔吉特公司制备）。在本实验中，使用了一个Poly-ARNA控制试剂盒和一个单环cDNA合成试剂盒。采用AffymetrixGCOS软件进行数据归一化和比较分析。表达式分析的原始芯片数据显示在数据表1中。

逆转录和实时RT-PCR：

用M-MLV(Invitrogen)对含有总RNA2micro;g的10个样品进行逆转录)。 将cDNA样品稀释至8ng/micro;l。根据制造商的方案（应用生物系统），使用带有ABI 7900序列检测系统的SYBRGreenMaster混合物（应用生物系统，序列号4309155），对每种cDNA稀释液1mu;l进行一式三份定量分析。利用Primer Express软件设计基因特异性引物。采用18 S rRNA扩增作为归一化所有数据的内部对照（正向引物5-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3 和反向引物5-TGTCACTACCTCCCCGTGTCA-3 ）。基因特异性引物列于补充表2。相对定量方法（flflCT）评价各重复样品之间的定量变异。

微阵列数据分析：

所有的CEL文件都用AffymetrixGCOS软件进行处理生成CHP文件，每个芯片的TGT（塔吉特公司均值）缩放值为500。原始表达式数据列在数据表1中。

利用MAS5.0算法提取基因芯片芯片探针组的信号强度。为了确定喹啉酸处理与对照样品之间的差异表达基因，应用GCOS基线工具计算每个基因的log2转换信号比。另一种方法是将算法dChip应用于这些原始芯片数据，并利用“比较样本”工具计算每个基因的表达差异。对于每个时间点(6或24h处理)，探针集根据以下规则分配了显著的变化：基于MAS5.0算法的两个生物重复中的表达比(quinclorac与模拟处理)ge;2[即信号对数比(SLR)ge;1或单反le;1]；基于dChip算法的表达水平差异被认为是显著的。

EasyGO（http://bioinformatics.cau.edu.cn/easygo）（周和苏，2007年）和GeneBins（戈法德和韦勒，2007年）用于功能分类。MapMan（http://mapman.gabipd.组织）用于关键调控组分析。

结论：

基于微阵列的二氯喹啉酸调节转录本筛选：

为了鉴定二氯喹啉酸信号应答基因，采用57K亲本水稻全基因组阵列产生表达模式。模拟田间效应(钱和马，2004年；Abdallah等人，2006年；彭等人，2008年)，我们在处理后6小时和24小时用1.65米M喹氯酸（约400毫克/升）和1%DMSO喷洒3周龄水稻（日本粳稻品种组）植物作为模拟和提取RNA。两套采集生物复制品，共分析8个芯片。

将两种算法应用于基因芯片数据：MAS5和d芯片(Li和Wong，2001)。 通过GCOS基线工具和dChip样本比较工具，比较了二氯喹啉酸处理下每个基因的表达水平变化与MAS5算法的模拟处理。 我们选择了两种算法在喹啉酸处理过程中被认为有显著变化的探针集，以及在6或24小时内两种重复的探针集。总共有637个探针集，其表达水平在6或24小时发生变化(ple;0.05)；这些基因被认为是喹啉酸反应基因，以供进一步分析。 在补充表1中列出了每个探针集的详细表达式级别(基于MAS5算法)和注释。 在637个探针集中，626个探针集根据来自TIGR水稻基因组版本5的注释与551个位点ID相关联。有233个探针组上升6小时，173个上升24小时喹啉酸处理，其中76个上升6小时和24小时；有252个探针组下降6小时，82个下降24小时喹啉酸处理，14个下降6小时和24小时（图1）。

基于基因本体(GO)的喹啉酸反应基因功能分类：

FIGURE 1 | Venn diagram of rice genes (probe sets) responded to quinclorac.

我们采用GO分析获得了这些二氯喹啉酸反应基因。我们使用EasyGO（周和苏，2007年）分别搜索了GO在6小时和24小时处理时上升和下降探针组。以ple;0.05为临界值，下降探针集内没

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